Определение в зерне и муке вредных примесей грибного происхождения

11.07.2015

Как известно, некоторые фитопатогенные микроорганизмы, вызывая заболевания сельскохозяйственных культур, приводят вместе с тем к накоплению в зерне, а следовательно и в муке, вредных веществ или примесей. Потребление подобных продуктов может вызвать различные заболевания. Это прежде всего относится к спорынье, некоторым грибам рода Fusarium и головне. Специфические токсины спорыньи и некоторых представителей рода Fusarium делают хлеб ядовитым, а присутствие головня придает ему, кроме того, неприятный цвет и запах.
Поэтому, в случае надобности, следует пользоваться определенными приемами, позволяющими установить присутствие в зерне или муке вредных примесей грибного происхождения. Приемы анализа семенного материала на грибную и бактериальную инфекцию здесь не разбираются. С ними можно познакомиться по специальным руководствам.
По существующему в настоящее время ГОСТу № 304—55, Семена. Методы определения качества, издание стандартов, 1949) количество спорыньи и головни в зерне и продуктах его переработки нормируется. Так, в заготавливаемых пшенице и ржи содержание данных примесей не допускается более 1%. В пшенице и ржи распределяемой не допускается содержание головни и спорыньи более 0,2%.
В муке пшеничной содержание головни и спорыньи (вместе или отдельно) не должно быть выше 0,05%. В овсе продовольственно-фуражном — не более 0,5 %. В овсе крупяном и идущем для приготовления солода, в ячмене крупяном и мукомольном эти примеси (вместе или отдельно) не могут превышать 0,1 %.
Изложение некоторых приемов выявления интересующих нас примесей в зерне и муке мы начнем с рассмотрения методов определения спорыньи. Напомним, что на зараженных спорыньей колосьях зерновых культур, главным образом ржи, ко времени созревания вместо зерен образуются буро-фиолетовые «рожки». Рожки представляют собой разросшуюся в завязи цветка гробницу склероция. Крупные склероции гриба значительно больше зерна и их легко обнаружить при осмотре колоса. Мелкие склероции меньше нормального зерна и бывают скрыты в чешуйках. Их можно заметить только при внимательном осмотре колоса.
Если при осмотре зерна или при анализе его навески на засоренность в нем обнаружится спорынья, то по действующему ГОСТУ 3040-55, отбирают дополнительную навеску в 400 г и определяют в ней содержание этой примеси, которое выражают в процентах.
Значительно сложнее определить присутствие спорыньи в муке.
Ориентировочное определение спорыньи в муке может быть произведено при помощи прибора «Новус». Этот прибор предназначен для определения количества отрубей и минеральных примесей в муке. Метод ориентировочного определения спорыньи в муке при помощи прибора «Hoвус» рекомендован Государственной хлебной инспекцией.
Методика определения сводится к следующему. В нижнюю, суженную часть пробирки наливают до черты восьмого деления хлороформ с удельным весом 1,48. В него вносят 1 г муки, тщательно отобранной ложечкой из разных мест хорошо переметанного среднего образца. Пробирку закрывают пробкой и взбалтывают. Затем осторожно, покачивая и наклоняя пробирку, смывают частицы, оставшиеся на внутренних ее стенках.
К хлороформенной пробе в несколько приемов приливают 95%-ный спирт (в объеме пяти — семи делений пробирки). После каждого прибавления спирта содержимое пробирки взбалтывают. Добиваются, чтобы все частицы муки осели на дно пробирки. Так как удельный вес спорыньи значительно меньше удельного веса муки, спорынья всплывает, и в виде темных почти черного цвета (оболочки) или сероватых (внутренние частицы), крупинок располагается у стенок пробирок. Лупa облегчает рас-познавание частиц спорыньи.
Если в пробирку осторожно, без смешивания слоев прилить на один-два деления 0,1N едкий натр и серную кислоту (1:5), то через несколько минут щелочной слой и частицы спорыньи окрасятся в красно-фиолетовый цвет. Слой серной кислоты с частицами спорыньи приобретает розовую окраску. Интенсивность окраски зависит от количества спорыньи: она резкая при содержании спорыньи около 1% и едва заметна при содержании спорыньи 0,25%.
Более точные результаты можно получить подсчетом при. помощи лупы всплывших частиц спорыньи.

Более точен метод Е.И. Вайнштейна. Для него используют две навески по 20 г: одну — исследуемого материала и вторую — такого же материала, но содержащую определенное количество спорыньи (контроль).
Навеску помещают в фарфоровую чашечку, заливают ее 60—70 мл горячего 80%-ного спирта. Эту чашечку со смесью ставят на кипящую водяную баню yа 10 минут. При этом смесь помешивают. Затем жидкость сливают через чистую марлю. Остаток на марле два раза промывают 80-% ным спиртом, затем отжимают и высушивают в сушильном шкафу.
Образовавшийся при высушивании комок измельчают стеклянной палочкой и смешивают с 1,5 мл 25%-ной серной кислоты.
Через 30 минут смесь переносят в колбочку (или цилиндр) с притертой пробкой, приливают 30 мл серного эфира и ставят на 1 час на шюттель-аппарат. При отсутствии такого аппарата смесь взбалтывают вручную; затем колбу оставляют в покое до следующего дня. После этого жидкость фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр с хорошо пригнанной пробкой. Остаток на фильтре промывают чистым эфиром в том же цилиндре. Объем эфира в нем доводят при этом до 40 мл.
Готовят насыщенный па холоду раствор двууглекислого натра и приливают его в цилиндр (10 мл). Содержимое цилиндра хорошо встряхивают. Для определения присутствия спорыньи в исследуемом материале сравнивают окраску щелочного слоя с окраской жидкости в контрольной пробе.
По способу Гофмана спорынья определяется следующим путем. К 10 г муки, помещенной в цилиндр с притертой пробкой, приливают 20 мл эфира и 1 мл 20%-ной cepyой кислоты. Смесь хорошо взбалтывают и 3—4 часа настаивают, повторно взбалтывая время от времени. После этого ее фильтруют через бумажный фильтр.
Остаток на фильтре промывают чистым эфиром до получения 25 мл фильтратов. Фильтрат переносят в небольшой цилиндр, приливают 0,5 мл 7%-ного раствора двууглекислого натрия (бикарбонат — NaHCO3) и хорошо взбалтывают.
Содовый раствор извлекает красящее вещество спорыньи, собираясь в нижней части цилиндра. Если содовый раствор приобретает желто-бурый цвет с легким фиолетовым оттенком, это указывает на содержание в муке 0,5—0,1% спорыньи; если раствор становится фиолетовым — в муке содержится более 0,2% спорыньи.
Имеются некоторые данные, что частицы спорыньи могут быть обнаружены при помощи люминесценции. Этот факт представляет несомненный интерес и совершенно очевидно, что на данном принципе может быть построен метод диагностики загрязнения муки спорыньей.
При определении примеси головни в зерне и муке, следует иметь в виду, что наибольшее значение имеют возбудители твердой головни пшеницы.
В зерне головня может быть обнаружена в виде пораженных зерен или обломков последних, а также в виде распыленных спор. Число головневых зерен может быть подсчитано во взятой пробе (200 г зерна) и вес их определен взвешиванием. Можно использовать и приблизительный расчет. Средний вес здорового зерна пшеницы примерно равен 0,04, а головневого — 0,0185 г. При подсчете каждый обломок зерна принимается за половину целого. Результаты выражаются в процентах.
При молотьбе, транспортировке и т. д. происходит раздавливание мешочков головни. Освобождающиеся споры пачкают зерно, в результате чего появляется «головневое зерно» — «синегузочное» и «мараное». Как уже отмечалось, у синегузочного зерна споры головни покрывают лишь бородку, а у мараного — не только бородку, но и поверхность или бороздку. При установлении процентного содержания в навеске головневого зерна сннегузочпые и мараные зерна могут быть учтены изолированно и их вес выражен в процентах.
По существующим правилам организации и ведения технологического процесса на мельницах «Главмуки», зерно, содержащее головню в «мешочках» свыше 0,1% или мараные и синегузочные зерна свыше 10%, разрешается направлять на переработку только после мойки.
Для определения распыленных спор головни на зерне можно использовать прибор Акимова. Он состоит из следующих частей:
а) двух сосудов с притертыми пробками и градуированной нижней части;
б) конической колбы с корковой или резиновой пробкой для обмывания зерна от спор головни;
в) небольшого сита с металлической сеткой;
г) стеклянной пипетки с делениями по 0,25 мл;
д) щеточки для чистки сосуда и пробирок;
е) шкалы для определения количества головни в зерне.
При анализе берется навеска зерна в 25 г, освобожденного от мешочков головни и минеральных примесей. Навеску обливают в конической колбе бензином легких фракций (удельный вес 0,710—0,715) так, чтобы зерно было им слегка покрыто. Для этого надо взять 15—20 мл бензина. Бензин может быть заменен эфиром. Затем, закрыв колбочку, ее взбалтывают круговыми движениями в течение 30 секунд.
Для отделения из суспензии частиц оболочек зерна, волосков бородки и т. д. на металлическое сито помещают кружок из тонкой шелковой ткани и через нее процеживают бензин. Имеющиеся в нем крупные частицы задерживаются на ткани, а фильтрат, содержащий споры, поступает в градуированный сосуд. Зерна обмывают три раза, каждый раз новой порцией бензина. Бензин сливают через сито в один и тот же градуированный сосуд, а зерно при последней фильтрации высыпают в сито. Колбочка, в которой было зерно, еще раз промывается 2—3 мл бензина, который выливается на сито. Наконец, зерно на сите промывают небольшим количеством бензина.
Градуированный сосуд с бензином закрывают пробкой и оставляют в покое на 30—50 минут в зависимости от качества бензина. Чем легче бензин, тем меньше времени требуется для осаждения спор. Споры, которые задержались в конической части прибора, переводят в осадок при помощи стеклянной палочки.
После того, как споры осядут в градуированной части сосуда, отмечают, сколько делений занимает их объем. Каждое деление сосуда, равное 0,05 мл, занятое осадком, соответствует 0,02 г распыленной головни. Исходя из этого легко вычислить вес спор головни, приходящийся на 100 г зерна, т. е. их процентное содержание.
Бензин после фильтрования можно снова использовать для следующих анализов.
При содержании в зерне головни ниже 0,1% метод Акимова дает неточные результаты. Для обычных целей им пользоваться все же вполне можно, по в случае необходимости более точного анализа применяют метод центрифугирования.
Для этого 50 г зерна очищают от земли и других минеральных примесей. К зерну приливают 50 мл воды и хорошо взбалтывают. Мутный смыв разливают в четное число пробирок и центрифугируют. Споры оседают на дно пробирок. Воду из пробирок сливают, к осадку приливают небольшое количество дистиллированной воды и взбалтывают. Содержимое всех пробирок сливают в одну, взвешенную на аналитических весах пробирку, которую также центрифугируют. Воду сливают. Пробирку с осадком сушат в термостате в течение 20 часов или в сушильном шкафу при 105° в течение трех-четырех часов до постоянного веса. Вес головни определяют по разнице в весе пробирки с головневыми спорами после высушивания и веса чистой пробирки.
При небольшом количестве распыленных спор головни и необходимости точного их определения применяют метод прямого подсчета спор под микроскопом. Это делается следующим образом. Навеску зерна, предварительно освобожденную от головневых зерен, промывают в воде. Для лучшего отделения спор головни вода должна иметь температуру около 30°. На 5 г зерна берется 10 мл воды. После 15-минутного пребывания зерен в воде содержимое пробирки взбалтывают, и вода переливается в центрифужную пробирку. После центрифугирования на дне пробирки образуется осадок спор головни, с которого сливается вода. К осадку спор добавляют 0,5 мл чистой воды, в которой споры суспензируются. Затем при помощи счетной камеры, общепринятой в микробиологических лабораториях методикой (при увеличении в 200—300 раз), учитывают количество спор, которое имеется в 0,1 мл полученной суспензии, что отвечает 1 г исследуемого зерна. Бес спор головни может быть примерно высчитан арифметическим путем. Установлено, что вес одной головневой споры, высушенной при 100° равен

Зерно, которое содержит грибницу пыльной головни, по внешнему виду трудно отличить от здорового, хотя оно иногда имеет матовый оттенок и слегка морщинистую поверхность. Грибница головни может быть обнаружена только на срезах под микроскопом.
В муке примесь головни можно определить следующим способом. Берут навеску муки в 5—10 мг и исследуют ее под микроскопом. Для просветления крахмальных зерен, маскирующих споры головни, муку можно обработать, при нагревании, смесью из десяти частей хлоралгидрата, пяти частей глицерина и трех частей 85%-ной соляной кислоты. Навеска муки распределяется на определенной поверхности предметного стекла. Число головневых спор просматривается в 30—50 полях зрения, а затем производится пересчет на взятую навеску. После этого можно по следующей формуле сделать расчет весового содержимого головни в муке в процентах:

где: M — полученное число спор; H — вес муки в миллиграммах.
Если спор в препарате слишком много, то взятую для анализа навеску смешивают с десятикратным количеством рисового крахмала. При окончательном пересчете полученный результат следует увеличить в 10 раз.
С достаточной точностью о весовом загрязнении муки спорами головни на основании подсчета спор можно судить по таблице 30, составленной для навесок в 5 и 10 мг.
При массовых анализах для облегчения работы можно муку не отвешивать, а брать специально заготовленной меркой, зная вес содержания в ней муки.
Определение в зерне Fusarium graminearum — возбудителя «пьяного хлеба» связано с известными трудностями, так как проявление признаков поражения у зерна может быть неодинаковым.

Различают две формы поражения семян фузариозом — глубокое (явное) и скрытое. Глубокое поражение семян возникает в результате раннего заражения колосьев фузариозом в поле, а именно: в фазе молочной и в начале восковой спелости зерна. Грибница фузариума пронизывает все зерно целиком и явно фузариозные зерна бывают щуплыми и обычно нежизнеспособными.
Скрытая форма фузариозного поражения семян возникает в случае позднего заражения или слабого раннего поражения растений на корню, а также при заражении семян в период уборки или при хранении зерна с повышенной влажностью. В таком случае грибница гриба распространяется в наружных слоях зерновки — в перикарпе и семенной оболочке.
Явным признаком фузариоза является карминно-розовая окраска оболочки и эндосперма зерна, которую можно обнаружить при надломе. К косвенным признакам относятся легковесность зерна и наличие матово-серой оболочки.
Весьма характерны для фузарнозного зерна розово-оранжевые или желтовато-оранжевые коростинки на его поверхности, представляющие собой конидиальное плодоношение гриба.
Корочки или мелкие бугорки имеют воскообразную консистенцию. На ощупь они тверды. При надавливании распадаются на крупинки или полностью отделяются от зерна. Эти корочки и бугорки являются конидиальными подушечками. Чаще всего подушечки расположены около зародыша зерна, но иногда размещаются в виде тонкой полоски на его бороздке.
Для распознавания конидий гриба Fusarium воскообразные корочки на зерне смачивают водой и через 5— 7 минут, когда корочка размягчается, небольшие частицы их при помощи препаровальной иглы переносят на предметное стекло в каплю воды. Там эти частицы размешивают посредством той же иглы. При увеличении в 60— 70 раз хорошо видны конидии гриба Fusarium.
Иногда на фузариозном зерне имеются черные, углистые образования, представляющие собой плодовые тела — перитеции.
При определении явно фузариозных зерен берут навеску в 50 г и из нее, руководствуясь внешними признаками, отбирают все фузариозные зерна. Эти зерна взвешивают на точных весах. Полученный вес выражают по отношению к взятой навеске в процентах.
Зараженность семян грибами рода Fusarium, можно определить и методом проращивания зерна. Семена закладываются в чашки Петри (или растильни) на увлажненнуЮ стерильной водой фильтровальную бумагу, сложенную в три слоя па расстоянии 1,0-1,5 см одно от другого. Вместо фильтровальной бумаги можно использовать стерильный кварцевый или речной песок, которые также надо увлажнить. Чашки Петри оставляют при температуре около 20° в темноте и просматривают ежедневно в течение нескольких дней (до 7). Во время проращивания на зараженных семенах появляется характерный для фузариума нежный, пушистый мицелий, который обволакивает зерно и принимает вид пушистой, вначале паутинистой шапочки снежно-белого, нежно-розового или ярко-малинового цвета. Нередко часть зерна окрашивается в розоватый или малиновый цвет. С течением времени на зараженных семенах появляются видимые простым глазом мелкие оранжевые коростинки, Таким путем можно легко установить, все ли семена, отобранные как фузариозные, на самом деле поражены этим грибом.
Распознать скрытые формы фузариоза зерна трудно. Признаком заболевания считают розоватое или малиновокрасное окрашивание зерна, его морщинистость и вздутость. Розоватая окраска, впрочем, может быть следствием и других заболеваний зерна.
Значительный процент ненормально крупных, как бы вздутых морщинистых и мелких сморщенных зерен также служит признаком скрытого фузариоза.
Определение скрытой формы фузариозного поражения производится следующим путем. Из анализируемой пробы зерна подряд берут 400 семян. Их раскладывают на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу, помещенную в чашки Петри (или растильни), и ставят на проращивание. Затем на седьмые сутки просматривают состояние опытных семян. На некоторых из них замечается поражение фузариозом, другие же дают нормальный рост. Ba семенах может проявиться фузариоз двух типов — сильный и слабый. При слабом поверхностном поражении на плодовой оболочке зерна имеется белый пушок грибницы, а колеоптиль и корешки проростков буреют (загнивают). При сильном поражении загнивают и стебелек и корешки. На загнивших семенах развивается пушок грибницы. Иногда появляются коростинки ярко-оранжевого цвета.
При желании выявить исключительно внутреннюю глубокую пораженность семян фузариумом, а также в случае сильного заражения семян сапрофитными грибами, мешающими выявлению мицелия Fusarium graminearum, отобранные семена перед раскладыванием на проращивание должны быть дезинфицированы. В качестве дезинфицирующего раствора может быть использован 0,5%-ный раствор марганцево-кислого калия, в котором семена выдерживают 20 минут. После просушки семян фильтровальной бумагой их раскладывают в чашки Петри так же как и в предыдущем анализе. После дезинфекции зараженность семян уменьшается за счет уничтожения поверхностной инфекции.
При лежании зерна в течение 2—4 лет мицелий гриба теряет способность прорастать. Однако существенной ошибки при анализе от этого не происходит, так как токсические свойства зерна также со временем падают, и этот процесс идет более или менее параллельно с уменьшением жизнеспособности мицелия гриба.
Допустимый для пищевого зерна максимум фузариозного поражения не должен превышать 3—5%.
Определение гриба Fusarium в муке встречает большие затруднения. Приблизительные результаты можно получить при микроскопическом анализе муки. Присутствие гриба в муке можно определить так жe методом посевов муки на питательные среды, но это удается сделать лишь при наличии свежих образцов муки.