Методы определения содержания крахмальных зерен, поврежденных механическим воздействием

29.10.2014

Основной предпосылкой для решения поставленного вопроса о роли механического повреждения крахмала является удовлетворительный метод определения его содержания в муке. Характер повреждения зерен весьма различен и с трудом поддается точному описанию.
Так, в зависимости от консистенции эндосперма и особенностей рабочих органов измельчающих машин на поверхности зерна крахмала могут появляться радиальные трещины, или же он полностью расщепляется на отдельные кусочки, либо на нем образуются щербинки с одной или нескольких сторон. Следовательно, визуальное наблюдение констатирует наличие поврежденных зерен, но еще не выражает степень повреждения.
В результате исследований удалось разработать прямой метод учета зерен крахмала с поврежденной оболочкой, который хорошо коррелирует с величиной осахаривающей способности изучаемых образцов. Он основан на избирательном окрашивании водной суспензии муки последовательно сафранином О и ниагарой голубой 4Б. Первая краска (молекулярная масса 350) легко проникает внутрь неповрежденного зерна крахмала, окрашивая его в розовый цвет. Вторая краска (молекулярная масса 992) не может проникнуть через наружную мембрану неповрежденных зерен и окрашивает в голубой цвет только поврежденный крахмал. Таким образом, при микроскопировании окрашенных суспензий голубые зерна поврежденного крахмала хорошо выделяются на общем розовом фоне и могут быть подсчитаны с достаточной точностью. В данном случае результаты непосредственно выражают количеством поврежденных зерен по отношению к общему содержанию крахмальных зерен в поле зрения препарата.
Более широко используются методы количественной оценки степени повреждения крахмала, основанные на определении эффекта, вызванного повреждением, а не количества поврежденных зерен. Способ, основанный на этом принципе, был предложен достаточно давно. Сущность его заключается в определении интенсивности окраски йодом раствора амилозы, извлекаемой из поврежденного крахмала при точно соблюдаемых условиях.
Величина амилозного числа, называемого также голубым числом, выражает степень повреждения, так как из незатронутых крахмальных зерен при данных условиях опыта амилоза практически не переходит в раствор.
Колориметрический метод был модифицирован в сторону ускорения и уточнения хода анализа. Амилозу из муки извлекают специальным растворителем с одновременным осаждением белков (раствор формамида с сульфосалициловой кислотой). Для ускорения процесса экстракции суспензию муки извлекают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 50° С, затем раствор фильтруют и после добавления раствора йода спектрофотометрически определяют поглощение света при длине волны λ=555 нм. Результаты, выраженные величиной оптической плотности, дают хорошую воспроизводимость.
Другой вариант метода, основанного на принципе определения количества йода, сорбированного поврежденными зернами крахмала, предусматривает добавление к суспензии избытка йода и определение оставшегося в растворе йода амперометрическим титрованием.
Большинство используемых в настоящее время методов оценки степени повреждения зерен крахмала основано на принципе определения количества продуктов гидролиза, образующихся под действием на крахмал амилаз. Эти методы, разнообразные по принципу воздействия на крахмал, предложены во многих вариантах, существенно отличающихся друг от друга. Так, в более ранних исследованиях взаимосвязи содержания поврежденного крахмала с технологическими свойствами муки степень повреждения оценивали по количеству мальтозы, образовавшейся в суспензии пшеничной муки под действием препарата β-амилазы пшеницы. Собственная β-амилаза исследуемой муки предварительно инактивируется обработкой кипящим этанолом. В дальнейшем был предложен вариант этого метода; инактивация собственной β-амилазы муки осуществляется под действием 0,1 н. раствора соляной кислоты. Вместо препаратов пшеничной β-амилазы используются вытяжки соевой муки, богатые этим ферментом. Данные, полученные по обоим вариантам, совпадают.
Был предложен также метод, основанный на применении α-амилазы солодового экстракта, высокоактивного по этому ферменту (160 единиц Саидстедта — Ниин — Блиша). Данные количества образовавшейся мальтозы сопоставляли с кривыми накопления мальтозы, полученными при обработке муки, содержащей известное количество поврежденных зерен крахмала.
Был предложен метод, который заключался в том, что в исследуемой муке предварительно инактивировали собственные амилазы обработкой трихлоруксусной кислотой с н-бутанолом. К полученной суспензии муки добавляли препарат β-амилазы солода с активностью 2000 единиц Линтнера. Гидролиз суспензии проводили в тех же условиях, что и при определении осахаривающей способности муки, Кроме того, предварительно определяли содержание восстанавливающих сахаров, находившихся в муке до начала опыта. Количество мальтозы, образовавшейся в этих условиях при действии β-амилазы (за вычетом уже присутствующей в муке), выражается как индекс повреждения крахмала.
В отличие от изложенного другой метод учитывает количество образовавшейся в течение 1 ч мальтозы при добавлении в мучную суспензию пшеничного солода, активного по α-амилазе (около 1000 единиц СНБ), и без учета имевшейся в муке мальтозы.
Для выявления наиболее рационального метода определения степени повреждения крахмальных зерен изучали кинетику гидролиза нативного и поврежденного крахмала под действием препаратов бактериальной β-амилазы. При этом было показано, что амилолиз пшеничной муки и поврежденного крахмала обнаруживает две четко выраженные фазы: фазу быстро повышающейся скорости гидролиза и фазу постоянной скорости этого процесса, Гидролиз нативного крахмала протекает значительно медленнее. На основании этих данных было предложено принять для оценки количества поврежденного крахмала (или степени его повреждения) количество мальтозы, образовавшейся в течение первого периода первой фазы, до начала снижения скорости гидролиза. Для большинства изученных образцов муки это соответствует 17 мин гидролиза мучной суспензии с добавлением бактериальной α-амилазы при температуре 30° С.
В других исследованиях было обращено внимание на то, что предложенные методы определения поврежденного крахмала требуют слишком много времени для проведения анализа (от 1 до 4 ч) и поэтому мало пригодны для текущего контроля качества муки, В связи с этим предложено сократить период осахаривания мучной суспензии до 15 мин, уменьшить размеры навески до 1 г, а в качестве источника α-амилазы применять препарат Роциме 33, выделяемый из плесневых грибов. Полученные величины образовавшейся мальтозы могут быть переведены в количество поврежденного крахмала путем умножения на эмпирически найденный коэффициент 1,64. Этот фактор был рассчитан, исходя из того, что при полном ферментативном расщеплении клейстеризованного крахмала в среднем получается около 61,0% мальтозы. Сопоставляя количество мальтозы, полученной при гидролизе исследуемой мучной суспензии, с этой величиной, можно рассчитать и коэффициент для перевода мальтозы в процент осахаренного крахмала.
Величины, полученные этим методом, хорошо коррелируют с данными метода Сандстедта — Маттериа.
По методу, предложенному Американской Ассоциацией зерновых химиков, предусматривается 15-минутный автолиз мучной суспензии препаратом α-амилазы активностью в 5000 единиц СНБ. Количество находившейся в муке мальтозы также учитывается при окончательных расчетах. Как видно из приведенных материалов, изложенные методы значительно отличаются друг от друга. В одних случаях определяется эффект только β-амилазы, в других — суммарное воздействие α- и β-амилазы, так как последняя практически всегда находится в препаратах амилазы солода.
Сильно различаются также и способы выражения количества поврежденного крахмала или степени его повреждения. Так, образец муки при анализе по методу Фарранда будет характеризоваться величиной содержания поврежденных зерен в 18%, тот же образец, исследованный по методу Салливена, получает характеристику в 15 единиц, а по методу Доиельсоиа — Ямазаки — в 6,6%. Конечно, такое разнообразие в способах выражения изучаемого показателя сильно затрудняет сопоставление результатов исследования. В связи с этим были проведены специальные работы по сравнительному изучению девяти различных методов определения содержания поврежденного крахмала в муке. При этом сопоставлялись методы как основанные на определении количества йода, сорбированного крахмалом, так и основанные на учете ферментативного гидролиза с применением различных препаратов. Кроме того, также учитывалось количество необходимых реактивов, число отдельных манипуляций, продолжительность выполнения одного анализа и воспроизводимость результатов. Наилучшую воспроизводимость, т. е. наименьший коэффициент вариации, имеет метод, предложенный Вилльямсом и Феголом, основанный на колориметрическом определении растворенной амилозы (метод Лаборатории по изучению зерна — Канада). Он характеризуется также и более низкой стандартной ошибкой опыта, наименьшей продолжительностью выполнения и минимальным количеством применяемых реактивов. В этих же исследованиях был вычислен коэффициент корреляции между величинами содержания поврежденного крахмала, полученными различными методами. Эти коэффициенты были достаточно высокими, показывая тем самым достоверную связь данных результатов разных методов. Исследование большого количества образцов позволило вывести уравнение регрессии между величинами, получаемыми различными методами.
Таким образом, имеется возможность сопоставлять результаты определения крахмала, поврежденного механически, полученные разными методами.
При изучении степени повреждения крахмальных зерен в различных условиях помола вновь был подвергнут экспериментальному изучению вопрос о методе ее определения.
Сопоставление ферментативного способа определения с применением амилаз плесневых грибов показало, что он не является достаточно чувствительным, и коэффициент вариации у результатов, получаемых при его использовании, выше, чем у колориметрического метода Вилльямса — Фегола. Недостатком последнего является то, что получаемые цифры относительны, показывают только оптическую плотность раствора амилозы, окрашенной йодом. Поэтому внесли предложение определять не только количество амилозы, перешедшей в раствор в результате повреждения крахмальных зерен, но и общее количество амилозы в отдельной пробе, находящейся в навеске муки. Для этой цели подходит ускоренный метод колориметрического определения амилозы, предложенный недавно. Таким образом для образца муки можно получить две величины: общее количество амилозы и количество амилозы, способной переходить в раствор после механического повреждения крахмальных зерен. Применение этого метода позволит значительно уточнить данные по степени повреждения крахмала при различных способах измельчения зерна.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: