Растворимость клейковинных белков

28.10.2014

Одним на первых методов характеристики силы клейковины был предложенный еще в 1929 г. способ определения ее набухаемости и растворимости в слабых растворах органических кислот. Крепкая клейковина, помещенная в 0,005 н. раствор молочной кислоты, набухает, тогда как слабая клейковина при этих условиях растворяется. Предложенная проба набухаемости клейковины базировалась на приблизительном измерении объема набухших кусочков в узкогорлой колбе, что не могло давать точных результатов. Тем не менее на протяжении многих лет этим методом пользовались для характеристики качества пшеницы в Европе, сопоставляя полученные данные с данными определения свойств муки и клейковины другими методами.
Значительным усовершенствованием этого принципа определения свойств клейковины явилась предложенная позже методика нефелометрического учета количества растворенного в слабой органической кислоте белка клейковины. В дальнейших исследованиях данные о лучшей растворимости слабой клейковины в органических кислотах, так же как и в некоторых других растворителях, были подтверждены многими исследователями. Так, в цитированных работах качество клейковины разных сортов пшеницы сопоставляли с количеством белка клейковины, растворимого в 0,05 н. растворе уксусной кислоты и в 12%-ном растворе салицилата натрия. Слабая и очень слабая клейковина растворяется в салицилате значительно больше, чем клейковина нормальная и крепкая (табл. 56). Растворимость клейковинных белков в уксусной кислоте заметно выше, чем в салицилате, и различия между клейковиной нормальной и слабой по величине их растворимости в этом случае почти незаметны, но крепкая клейковина все же отличается по этому показателю от слабой.

Растворимость клейковинных белков

В дальнейших работах этих же авторов для характеристики клейковины по растворимости ее белков применяли уже только 12%-ный раствор салицилата натрия. Качество клейковины сопоставили с величиной ее растворимости в салицилате. При распределении изученных образцов по качеству на три группы видно, что количество растворимого белка закономерно повышается при переходе от клейковины крепкой к нормальной и слабой. К сожалению, эти интересные данные не были математически обработаны, вследствие чего не было выяснено, насколько существенны отмеченные различия в растворимости. Желательно было бы также рассчитать коэффициенты корреляции между качеством клейковины, выразив его в количественных показателях и составив уравнение регрессии для изученных признаков. В тех же работах было также четко показано, что укрепление клейковины различными способами (сушкой при жестких режимах или облучением γ-лучами) заметно снижает растворимость ее белков в слабой уксусной кислоте или в салицилате. Такой же эффект производит и воздействие на клейковину олеиновой кислоты, которая резко укрепляет клейковинный гель.
Аналогичные данные были получены при изучении сортов пшеницы разного качества. Определение растворимости суммарных белков показало, что в сильной пшенице преобладают белки, труднорастворимые в салицилате натрия, а в слабой — более легкорастворимые. В этом случае непосредственно свойства клейковины не определяли, о них судили по косвенным показателям.
Растворимость клейковины в салицилате не всегда коррелирует с качеством ее, определяемым другими методами.
Иной методический подход был использован для сопоставления свойств клейковины с ее растворимостью и применен в исследованиях. В данном случае сопоставляли реологические свойства клейковины из пшеницы нормальной, поврежденной клопом-черепашкой и проросшей в процессе ее автолиза. При этом определяли модуль упругости-эластичности и вязкость клейковины и теста на приборе по измерению деформации сдвига в плоскопараллельном зазоре (прибор Николаева).
Опыты показали, что в процессе автолиза происходит снижение упругости клейковины и теста у всех изученных образцов как нормального, так и дефектного зерна. Исходные данные, характеризующие реологические свойства и растворимость белков, у этих образцов разнятся очень сильно в течение всего процесса автолиза. По мере автолиза теста из слабой муки модуль упругости-эластичности и вязкость теста понижаются, а растворимость белков в слабой уксусной кислоте повышается.
При изучении фракционного состава зерна пшеницы нормальной и поврежденной клопом-черепашкой было показано, что в последней резко увеличивается содержание альбумина и глобулина за счет соответствующего снижения содержания глиадина и глютенина.
Приведенные материалы убедительно свидетельствуют о том, что слабая клейковина отличается от сильной по растворимости ее белковых компонентов.
В этих исследованиях изучали белки, извлеченные из нормальной и слабой клейковины, методами гельфильтрации и электрофореза. Как видно из рисунка 47, при гельфильтрации уксуснокислых растворов клейковины на Сефадекс Г-100 количество фракций для белков нормальной и дефектной клейковины получается одинаковым. Учитывая, что фракция I выходит в свободном объеме, а фракция II по объему выхода близка к ней, обе они идентифицированы как глютениновые (табл. 57), Количество высокомолекулярной фракции I у свежеотмытой слабой клейковины на 30% превышает содержание соответствующей фракции нормальной клейковины. Однако в процессе автолиза слабой клейковины происходит сильное снижение содержания высокомолекулярной фракции II при соответствующем увеличении количества фракции III. В итоге автолитического распада клейковины, сопровождающегося повышением растворимости этих фракций в слабой уксусной кислоте, происходит снижение содержания суммы высокомолекулярных фракций белка. Процесс автолиза не оказывает влияния на соотношение суммы высоко-и низкомолекулярных белков клейковины нормального зерна. Отсюда можно сделать вывод, что резкое ослабление клейковины пшеницы, поврежденной клопом-черепашкой, сопровождается (или, точнее, является следствием) деполимеризацией клейковинных белков.
Растворимость клейковинных белков

Диалогичные данные, свидетельствующие о том, что при повреждении зерна пшеницы клопом-черепашкой происходит заметная деполимеризация белка, были получены при применении иной методики исследования. Хроматография извлеченных белков показала изменение соотношения пиков высоко- и низкомолекулярных фракций.
Растворимость клейковинных белков

Электрофорез в крахмальном геле уксуснокислых растворов клейковины и выделенного из нее глиадина проводили также с использованием клейковины свежеотмытой и автолизированной. Исследование компонентного состава клейковины нормальной и слабой показало, что изученные образцы имеют спектр, состоящий из 16 и 15 компонентов соответственно; у клейковины слабой фракция, обладающая наименьшей подвижностью, более четко выражена (рис. 48). В процессе автолиза в обоих случаях происходит уменьшение общего числа фракций: за счет одной, относящейся к группе менее подвижных (клейковина слабая), и трех — в зоне более подвижных (клейковина нормальная).
Растворимость клейковинных белков

Интенсивность окраски оставшихся фракций в зоне менее подвижных значительно уменьшается, а у автолизированной слабой клейковины они становятся едва заметными. На верхней поверхности геля во всех случаях обнаружен неразделенный стартовый белок — глютенин.
При тех же условиях электрофореза глиадин клейковины нормальной муки имеет 15 фракций, а слабой — 17 за счет появления фракций, обладающих наименьшей подвижностью, а также фракции, которая приближается к менее подвижным (рис. 49).
Растворимость клейковинных белков

Отличительной особенностью глиадина автолизированной клейковины нормальной и слабой является увеличение общего количества фракций в результате появления новых в зоне менее подвижных. Кроме того, менее подвижные фракции глиадина автолизированной слабой клейковины очень плохо выражены. Для определения молекулярной массы глиадина клейковины тех же образцов фракции его, полученные разделением на Сефадекс Г-100 — сверхтонком, были подвергнуты хроматографии в тонком слое с применением Сефадекс. В качестве свидетелей использовали белки известной молекулярной массы: цитохром С, рибонуклеаза, ингибитор трипсина, овальбумин и другие. При этом было обнаружено, что фракции I и II глиадина, составляющие около 20% всего белка для нормальной и 23% для слабой клейковины, представляют собой, очевидно, примеси низкомолекулярного глютенина, так как имеют молекулярную массу соответственно 420000 и 11 700. Присутствие в глиадине подобных фракций глютенина было доказано ранее другими авторами.
Остальные фракции глиадина имели молекулярную массу в пределах от 18 000 до 32 000. После автолиза слабой клейковины, однако, было обнаружено, что молекулярная масса фракции III глиадина значительно повысилась. Это можно объяснить ассоциацией его молекул вследствие появления новых функциональных групп при разрыве полипептидных цепочек под влиянием протеолитических ферментов, внесенных клопом-черепашкой.
Стабильность электрофоретического спектра глиадина клейковины пшеницы, поврежденной этим вредителем, была недавно показана в исследованиях, сопоставлявших клейковину различных сортов пшеницы; независимо от качества клейковины спектр глиадина сохранял свою сортовую специфичность.
Все изложенные данные свидетельствуют о том, что слабая клейковина отличается от сильной по растворимости белков и по соотношению фракций белков разной молекулярной массы. Наряду с этим существенных различий во фракции глиадина обнаружить не удается. Отсюда вытекает предположение, что наибольшие изменения могут быть обнаружены во фракции глютенина. К сожалению, более подробного изучения глютенина сильной и слабой клейковины, особенно в процессе автолиза, до сих пор не проводили. Между тем для исследования глютенина в настоящее время разработаны такие методы, как гельфильтрация и электрофорез после восстановления его дисульфидных связей, которые могли бы дать ясное представление о возможной роли глютенина в определении реологических свойств клейковины и ее изменениях в процессе автолиза,
В серии исследований были изучены физико-химические показатели клейковины разного качества. Наряду с определением растворимости клейковины в салицилате натрия и в уксусной кислоте и содержания дисульфидных связей определяли также характеристическую вязкость, удельный гидродинамический объем и осевое соотношение молекулы в растворах салицилата с добавлением мочевины или бисульфита или без добавления. Приведенные в таблице 58 данные показывают, что крепкая клейковина отличается от слабой более низким значением всех вискозиметрических показателей. Это свидетельствует о более компактной конформации частиц крепкой клейковины в растворе и меньшей степени асимметрии ее белковых молекул, чем у слабой. Добавление к раствору клейковины мочевины разрушает водородные связи в макромолекуле белка и приводит к возникновению более рыхлой, развернутой структуры клейковинного белка. Вязкость раствора при этом повышается, но конформационные различия между частицами клейковины разного качества сохраняются. Добавление в раствор клейковины сильного восстановителя — бисульфита — разрушает дисульфидные связи молекулы белка, в результате чего образуются белковые частицы меньшего размера. Исчезают гидродинамические различия между крепкой и слабой клейковиной, характеристическая вязкость и удельный гидродинамический объем частиц белка становятся практически одинаковыми. Эти данные были подтверждены в разных вариантах опытов, в том числе и на клейковине одного и того же сорта пшеницы, выращенной в разных условиях. Египетская пшеница Гиза 145, обладающая крепкой клейковиной, в условиях Москвы давала слабую клейковину, однако по растворимости белков, характеристической вязкости растворов и удельному гидродинамическому объему она значительно превосходила крепкую клейковину.
Растворимость клейковинных белков

Существенный интерес представляют данные о воздействии на клейковину и тесто тяжелой воды. При обработке тяжелой водой происходит укрепление сырой клейковины — она становится более упругой и менее растяжимой. Диалогичные изменения происходят и при замесе теста с применением тяжелой воды. Эти данные были подтверждены и другими авторами. В дальнейших работах изменение реологических свойств клейковины под влиянием тяжелой воды сопоставляли с кинетикой дейтерирования клейковинного белка, измеряемой непосредственно по количеству включенного в него дейтерия. Препараты сухой лиофилизированной клейковины обрабатывали тяжелой водой в течение разного времени (от 5 мии до 48 ч). После окончания экспозиции суспензию клейковины быстро замораживали в жидком азоте и полностью удаляли тяжелую воду лиофилизацией. В сухих препаратах количественно определяли содержание дейтерия, выражая его в атомных процентах. На рисунке 50 показана кинетика дейтерирования и изменения реологических свойств клейковины слабой; чем больше лабильного водорода заместилось в клейковинном белке на дейтерий, тем сильнее укрепилась клейковина. Сопоставление влияния дейтерия на клейковину слабую и крепкую показывает, что при равных сроках экспозиции крепкая клейковина укрепляется сильнее, чем слабая (табл.59).
Растворимость клейковинных белков

Эффект изменения свойств клейковины под влиянием дейтерия может быть объяснен суммарным увеличением прочности водородных связей в молекуле белков при замене лабильных атомов водорода на дейтерий. Подводя итоги этой серии исследований в 1974 г., автор пришел к выводу, что крепкая клейковина отличается от слабой более компактной упаковкой белковых молекул в составе высокомолекулярного комплекса макромолекулы клейковинного белка. Структурные отличия этих частиц обусловливают неодинаковую структуру образуемых ими гидратированных гелей, и это является непосредственной причиной различий в реологических свойствах клейковины разного качества. Неодинаковая плотность упаковки индивидуальных компонентов и частиц клейковинного белка, определяющая разнообразные свойства клейковины, обусловлена различным количеством, расположением и прочностью дисульфидных мостиков и более лабильных водородных связей.
Растворимость клейковинных белков

Для более полного освещения проблемы свойств клейковины необходимо провести еще очень большой объем исследовании с учетом таких факторов, как роль ионных взаимодействий, возможность образования комплексов белков с углеводами и липидами, и накопить экспериментальный материал, всесторонне освещающий эти необычайно сложные вопросы биоорганической химии.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: