Липиды в клейковине зерна пшеницы
Изучение липидной фракции, обнаруживаемой в клейковине, начато относительно недавно, хотя факты, свидетельствующие о ее существенном значении, были известны 50 лет тому назад.
Предположение о том, что наличие свободных липидов в муке необходимо для процесса формирования клейковины и теста, было основано на методической ошибке — автор экстрагировал липидную фракцию после сушки муки при температуре выше 100°С, что вызвало полную денатурацию белков, В серии опытов было показано, что удаление растворимых в этиловом или петролейном эфире липидов не препятствует формированию клейковины. Вместе с тем этими же исследованиями было установлено, что клейковина обладает способностью поглощать в процессе замеса теста жир, не только находящийся в муке, но и прибавленный в виде эмульсин или в эфирном растворе. Одновременно проведенное изучение процесса созревания пшеничной муки выявило чрезвычайно важные факты сильного воздействия на свойства клейковины продуктов гидролиза жира, в частности олеиновой кислоты. Механизм этого специфического воздействия, однако, оставался невыясненным,
Позднее гипотеза о первостепенном значении фосфолипидов в формировании теста и клейковины была выдвинута в связи с представлениями о промежуточном и прикрепленном белке в эндосперме пшеницы, но прямых экспериментальных доказательств не было. В наиболее законченном виде теория, представляющая кленковинный комплекс как состоящий из белковых пластинок, связанных между собой слоями фосфолипидов, была выдвинута в 1960-х годах.
Наличие определенных фактов и гипотез выдвинуло необходимость более детального изучения значения не только собственно жиров, т. е. нейтральных триглицеридов и продуктов их гидролиза или окисления, но и других фракций липидов в процессе образования клейковины. Во многих исследованиях было показано, что при применении такого растворителя, как насыщенный водой н-бутанол, можно удалить из пшеничной муки не только свободные, но и почти все связанные липиды. При этом клейковина из такой муки отмывается легко, хотя качество ее значительно изменяется. Несколько позже было доказано, что изменение свойств клейковины, отмытой из полностью обезжиренной муки, обусловлено самим растворителем, т. е. н-бутанолом.
В работах других авторов также подтвердилось, что присутствие в муке и клейковине свободных липидов не является обязательным для формирования гидратированного клейковинного комплекса. При этом было установлено, что даже такой способ удаления связанных липидов, как кипячение в 96%-ном растворе этанола, не гарантирует полного извлечения последних.
Дальнейшие исследования были направлены на изучение роли свободных и связанных липидов как факторов, воздействующих на свойства клейковины и теста. Обзор более ранних работ в этом направлении дан в монографиях.
Подробно изучали также переход свободных липидов муки в связанное состояние при замесе теста для выяснения зависимости этого процесса от условий замеса и определения, происходит ли при этом избирательное связывание отдельных фракций липидов.
Было установлено, что количество липидов, переходящих в связанное состояние, в значительной степени зависит от интенсивности замеса. Наименьшее связывание отмечается при замесе на тихоходных тестомесилках и наибольшее — при замесе по непрерывному способу приготовления хлеба, характеризующемуся наибольшим расходом энергии на замес. Опыты показали, что при замесе теста происходит неизбирательное связывание триглицеридов; диглицериды связываются в большей степени, чем стеролы. Связанные полиненасыщеиные жирные кислоты составляют только незначительную часть от общего количества перешедших в связанное состояние липидов. Следует отметить, что во всех опытах в тесто добавляли жиры в виде специальных пекарских жировых композиций, а также соевую муку, содержащую около 22% масла. Естественно, что включение липидов, содержащих к тому же значительное количество полинеиасыщенных жирных кислот, могло исказить картину связывания клейковиной липидов муки. Более правильная методика исследования была применена позже авторами, изучавшими распределение фракций липидов собственно муки в клейковине. Отмытую и лиофилизированную клейковину экстрагировали повторно смесью бензина с этанолом, полученную сумму липидов концентрировали в вакуум-испарителе и изучали методом тонкослойной хроматографии на силикагеле. Для изучения распределения липидов по фракциям клейковины последняя разделялась на глиадин, экстрагируемый из 0,05 M уксуснокислого раствора клейковины 70%-ным раствором этанола и на глютенин, осаждаемый из этого же раствора нейтрализацией до pH 6,75. При этом получали еще одну фракцию — нерастворимую в уксусной кислоте часть клейковины, составляющую около 16% суммарного белка. В каждой фракции клейковины определяли содержание белка, суммарное количество липидов и их состав.
Как видно из данных таблицы 35, наибольшее количество липидов содержит клейковина и извлеченный из нее глиадин. По соотношению фракций липидов клейковина и ее нерастворимый осадок очень мало отличаются от муки, но очень сильные различия наблюдаются в составе липидов глиадина и глютенина (табл. 36). В глиадине около 75% всех липидов составляют полярные липиды, тогда как в глютенине полярных липидов втрое меньше, а около 60% всех липидов приходится на триглицериды. Правильное понимание этих фактов тем не менее затруднительно.
Возможно, что в данном случае в клейковине находились липопротеиновые комплексы, избирательно присоединявшиеся как к глиадину, так и к глютенину. Ho возможно и другое, как предполагают сами авторы, — эти комплексы могли быть разрушены при обработке клейковины 70%-ным раствором этанола и после осаждения глютелина остались в растворе и попали в глиадиновую фракцию.
Переход различных фракций липидов при замесе теста из свободного в связанное состояние изучали и позднее. В данном случае фракции свободных липидов определяли методом последовательного экстрагирования лиофилизированиого теста диэтиловым эфиром, а затем связанные липиды экстрагировали насыщенным водой н-бутанолом. Как показали эти же авторы в предыдущих исследованиях, н-бутанол извлекает практически все связанные липиды, причем результаты совпадают с данными, полученными при экстракции после полного кислотного гидролиза клейковины.
Представленные в таблице 37 данные свидетельствуют о том, что в процессе замеса теста большая часть свободных липидов переходит в связанное состояние. Определение липидного фосфора показало, что в муке большая часть его находится в связанном состоянии, а после замеса во фракцию связанных липидов переходят почти все фосфолипиды (табл. 38). Добавление в тесто при замесе пекарского жира с точкой плавления 43° С повышает содержание свободных липидов, т. е. этот жир в меньшей степени связывается белковыми веществами муки при замесе, чем собственные липиды муки.
В серии исследований липиды клейковины были изучены более подробно с применением совершенной методики. При этом было уточнено понятие о свободных и связанных липидах. К первой группе относятся липиды, полностью извлекаемые из материала диэтиловым эфиром. Группа связанных липидов была дифференцирована в соответствии с предложением ВНИИЖ на две группы: связанные и прочно связанные липиды. Первые извлекаются из материала насыщенным водой н-бутанолом, метанол-хлороформенной смесью (по Фолчу) или обработкой горячим 96%-ным раствором этанола. Вторые могут быть выделены вслед за удалением свободных и связанных липидов только после щелочного гидролиза исследуемого материала.
Учитывая необходимость получения прочно связанных липидов в нативном состоянии, был разработан специальный метод извлечения их из пшеничной клейковины, основанный на ферментативном расщеплении белкового субстрата. По этому методу из муки экстракцией диэтиловым эфиром вначале извлекали свободные липиды, затем из нее отмывали клейковину. Лиофилизированную клейковину освобождали от связанных липидов кипячением в 96%-ном растворе этанола, затем суспендировали в фосфатно-цитратном буфере pH 5,5 и обрабатывали препаратом растительного протеолитического фермента—папаином. Липиды, освободившиеся после гидролиза белка, экстрагировали диэтиловым эфиром и исследовали методом тонкослойной хроматографии на силикагеле. При этом результаты довольно близко совпадают с данными, полученными методом щелочного гидролиза по ВНИИЖ (табл. 39).
Фракционный состав связанных и прочно связанных липидов клейковины представлен в таблице 40. Следует отметить, что приведенные данные сильно отличаются от цитированных результатов изучения липидов клейковины, особенно по содержанию группы полярных липидов.
Разработанный метод извлечения прочно связанных липидов ферментативным гидролизом белка был использован для изучения процесса взаимодействия клейковины с олеиновой кислотой. Опыты, проведенные с добавлением олеиновой кислоты в муку различной влажности, и определение количества извлекаемой из нее связанной кислоты (после удаления свободной олеиновой кислоты экстракцией диэтиловым эфиром) ясно показали, что по мере повышения влажности муки все большее количество последней переходит во фракцию прочно связанных и связанных липидов (табл. 41). Ho наибольшее содержание олеиновой кислоты обнаружено во фракции прочно связанных липидов при замесе теста влажностью 44,5%. Отмытая из теста клейковина содержит во много раз больше связанной олеиновой кислоты, чем мука.
Следовательно, взаимодействие олеиновой кислоты с клейковиной происходит только при наличии определенного количества влаги, и именно в этих условиях проявляется специфическое влияние кислоты на клейковину.
При исследовании комплекса клейковина — олеиновая кислота было обнаружено, что растворимость белковых компонентов значительно снижается. Гельфильтрация растворов комплекса клейковина — олеиновая кислота на Сефадекс Г-100 и Г-200 показала, что он содержит больше высокомолекулярных фракций белков, чем нормальная клейковина (51,6 и 38,8% соответственно).
При разделении комплекса клейковина — олеиновая кислота на белковые компоненты выяснилось, что кислота присоединяется как к глиадину, так и к глютенину, но при извлечении глиадина 70%-ным раствором этанола олеиновая кислота освобождается и переходит в свободном состоянии в спиртовой раствор. Глютеинновая фракция связывает олеиновую кислоту более прочно. Определение соотношения дисульфидных связей и сульфгидрильных групп в клейковиином комплексе показало, что он содержит больше дисульфидных связей и меньше HS-групп, чем контрольная клейковина. Вискозиметрические измерения показали, что диспергированные частицы комплекса клейковины с олеиновой кислотой характеризуются более компактной упаковкой по сравнению с частицами обычной клейковины.
Таким образом, исследования показали, что олеиновая кислота вступает во взаимодействие с белковыми веществами клейковины и основным условием для этого является наличие влаги. В связывании олеиновой кислоты участвуют как глиадин, так и глютенин, но последний присоединяет ее более прочно. Очень важным является то, что вся добавленная кислота при последующем ее извлечении оказывается во фракции свободных жирных кислот.
Иначе говоря, никакой глубокой деструкции ее при образовании комплекса не происходит. Возможное окисление олеиновой кислоты специально не изучали.
Интересные данные о влиянии непредельных жирных кислот на белковые вещества клейковины были получены в связи с изучением технологии производства японского продукта типа макарон, так называемого Тенобе-Сомен. Продукт вырабатывают из пшеничной муки с добавлением хлопкового масла и в готовом виде выдерживают в течение жаркого, дождливого периода года. После этого макароны приобретают необходимое качество, т. е. хорошую устойчивость при варке и соответствующую консистенцию. Для выяснения возможности изменений клейковинных белков при взаимодействии их с липидами хлопкового масла были поставлены опыты с прибавлением эфиров жирных кислот масла к препаратам клейковины и хранения смеси при высокой температуре (40°С) и различной относительной влажности воздуха. Опыты показали, что в исследуемой смеси происходит быстрое окисление эфиров олеиновой и линолевой кислот (рис. 40). При более высокой относительной влажности воздуха разрушение протекает медленнее. Одновременно резко снижается растворимость клейковинных белков в 0,1 н. растворе уксусной кислоты, происходящее, однако, только при относительной влажности воздуха не ниже 83%. Гельфильтрация растворов клейковинных белков до и после хранения с эфирами жирных кислот показала значительные изменения в соотношении полученных фракций (рис. 41 и 42). Клейковина после десятидневного хранения (при относительной влажности воздуха 96%) содержит меньше высокомолекулярных фракций, чем до хранения. В условиях хранения при нулевой относительной влажности воздуха никаких изменений в соотношении пиков при гельфильтрации не обнаружено. Это происходит вследствие снижения растворимости клейковинных белков при воздействии на них насыщенных жирных кислот или продуктов их окисления. Исследование суммарного аминокислотного состава белков показало, что при хранении клейковины с эфирами жирных кислот отмечено заметное снижение содержания лизина (до 70% от исходного количества), а также гистидина. Наряду с этим резко возрастает количество азота аммиака во фракции свободных аминокислот, Следовательно, все же происходят определенные изменения в белковых веществах клейковины при хранении ее с непредельными жирными кислотами. Эти данные убедительно показывают значение величины влажности окружающего воздуха (а следовательно, и влажности самого продукта) при взаимодействии клейковины с непредельными жирными кислотами и тем самым подтверждают приведенные данные.
При дальнейшем изучении влияния липидов и непредельных жирных кислот на клейковину следует учесть серию исследований, проведенных в последнее десятилетие, по взаимодействию окисленных липидов и жирных кислот с различными белками. Было показано, что цитохром С2 в присутствии окисляющейся линоленовой кислоты образует с ней нерастворимые комплексы и теряет свои ферментативные свойства. Наряду с этим в белке резко снижается содержание аминокислот, чувствительных к окислению. Так, содержание серина падает на 54% по сравнению с содержанием его в исходном белке. Изучение полученного комплекса белка с линоленовой кислотой показало, что 70% ее связано с белком посредством перокси-связи, а остальная часть — при помощи эфирной или С-С-связей. При высокой степени окисления линоленовой кислоты продукты, полученные при взаимодействии ее с цитохромом, обнаруживают полимеризацию посредством образования поперечных связей между многофункциональными свободными радикалами перокси-линолеата:
ООЛООП + П — ПООЛООП,
где П — белок;
Л — линоленовая кислота;
О — кислород.
При дальнейшем изучении взаимодействия переокислениых липидов с белками — трипсином, пепсином, α-химотрипсином и овальбумином — подтвердилось, что при этом происходит расщепление дисульфидных связей с выделением сероводорода. Количество серусодержащих аминокислот сильно снижается, а ферментативная активность падает. Также показана возможность полимеризации белков цитохрома, каталазы, трипсина, овальбумина в результате реакции с белками свободнорадикальных продуктов, образующихся из полиненасыщенных жирных кислот при их окислении. Продукты полимеризации белка нерастворимы в воде, а их растворимость в реактивах, разрушающих водородные связи, резко падает.
В более поздних работах была показана возможность реакции окисленных жирных кислот (на примере олеиновой) с альбумином в безводной среде.
Данные других авторов, изучавших взаимодействие водного раствора овальбумина с окисленным кукурузным маслом, подтвердили образование нерастворимого комплекса. Однако при этом не было обнаружено ковалентных связей между реакционноспособными группами белка и окисленными липидами.
Сопоставляя эти данные с фактами специфического воздействия непредельных жирных кислот (в частности, олеиновой), можно предположить, что и в этом случае происходит такое же взаимодействие.
Очень интересно высказанное Рубал и Таппель предположение о том, что в природных объектах окислению могут быть подвержены не только липиды, но одновременно и углеводы. При этом получается небольшое количество альдегидов. Последние также могут обусловить образование поперечных связей между макромолекулами белков со всеми вытекающими отсюда изменениями их свойств.
Очень мало изучено взаимодействие гликолипидов с клейковинными белками, имеющее, по-видимому, большое практическое значение. Постоянными компонентами липидной фракции пшеницы являются моно- и дигалактозил-диглицериды, взаимодействующие, как показали прямые опыты, с клейковиной. В случае глиадина образование комплексов происходит за счет водородных связей, а в случае глютенина — за счет гидрофобных. Для исследования процесса взаимодействия белков клейковины и других компонентов муки с гликолипидами был применен метод авторадиографии. Меченый по тритию галактозил-дидеканоил-глицерин добавляли в тесто, причем было обнаружено, что галактолипид в тесте в основном распределился в клейковине и только в очень ограниченном количестве в крахмале. При выпечке же произошло перераспределение гликолипида и большая часть его оказалась в клейстеризованном крахмале. Трактовка же этих фактов остается пока неясной. Возможное влияние гликолипидов на клейковину изучали только косвенным методом (пробной выпечкой хлеба). При этом было показано, что добавление гликолипидов (в форме галактозил-диглицеридов или сложных эфиров сахарозы и стеариновой кислоты) положительно влияет на величину объема хлеба из смесей пшеничной муки и высокобелковых препаратов соевой муки. Однако известно, что объем выпеченного хлеба не находится в прямой зависимости от качества клейковины, и далеко не всегда максимальный объем хлеба говорит о наличии наиболее крепкой клейковины. В данных работах свойства клейковины не исследовали и выводов о влиянии гликолипидов сделать нельзя.
He исследовано также взаимодействие с клейковиной и других полярных липидов, в частности фосфолипидов. При изучении этого взаимодействия следует принять во внимание возможность образования нерастворимого комплекса белок — фосфолипид — металл, в котором металл (магний, натрий или кальций) образует хелатные соединения в среде липопротеина. Учитывая присутствие в пшеничной муке солей металлов, такое взаимодействие следует считать вполне возможным.