Проламин и глютелин риса
Проламин риса составляет лишь самую незначительную часть белков зерновки — от 1,5 до 3,5% общего их количества.
В зависимости от сорта и, вероятно, от условий произрастания, соотношения альбумин : глобулин : проламин : глютелин колеблются от 1:12:5:81 до 2:4:2:92. Наименьшее содержание проламина обнаруживается в периферийных слоях эндосперма, а наибольшее — во внутренних. Повышение почти вдвое общего содержания белка в наружных слоях по сравнению с целым зерном происходит за счет альбуминовой и глобулиновой фракции.
Сопоставление различных методов извлечения проламинов риса показало, что наилучшие результаты дает непосредственная экстракция 70%-ным раствором этанола. Последовательное извлечение дистиллированной водой или 0,5 M раствором хлористого натрия и затем этанолом снижает выход белка более чем в два раза. Вероятно, проламины риса частично растворяются в воде или водно-солевом растворе. Кроме того, предварительная обработка по схеме Осборна обусловливает получение проламина, содержащего значительное количество примеси полисахаридов, вероятно глюканов, до 7% от массы белка, тогда как прямая экстракция 70%-ным раствором этанола дает препарат белка, содержащий около 0,3% примеси полисахаридов.
Исследования показали также, что наиболее чистые препараты проламина, содержащие до 16,7% азота, получались при осаждении спиртовых растворов белка ацетоном, а не при удалении этанола вакуум-дистилляцией или при разбавлении его водой. По-видимому, в последних случаях происходило образование комплексов проламина с растворимыми в воде полисахаридами.
Электрофорез в крахмальном геле позволил разделить проламин риса на два компонента; оба содержали некоторое количество примеси полисахаридов, а также полифенолы. Последние, вероятно, также образуют комплексы с белком, разрушающиеся в щелочной среде (pH 10,0).
Аминокислотный состав проламина риса, полученного метолом прямой экстракции 70%-ным раствором этанола, приведен в таблице 20.
Молекулярная масса его, определенная гельфильтрацией на Биогель Р-300, составила 3*10в5, т. е. намного выше, чем у глиалина пшеницы и ржи. Эти данные нуждаются в проверке.
Глютелин риса — оризенин — является главным запасным белком зерновки. Содержание его в эндосперме доходит до 93% общего количества белков, что резко отличает рис от злаков грибы пшеничных, в которых глютелины составляют не более 10—50% белковой фракции.
Как и другие глютелины, оризенин практически нерастворим и воде, солевых растворах и спиртах. Наилучшим растворителем для него является едкий натр (при pH 12,0); в этих условиях из эндосперма извлекается до 98% содержащегося в нем глютелина. При pH 10,0 большая часть глютелина выпадает в осадок.
Следует отметить, что даже при повторном переосаждении оризенин содержит значительное количество примеси углеводов и нуклеиновых кислот. Для изучения его структуры была разработана специальная методика выделения его в чистом виде последовательным растворением и осаждением по следующей схеме.
По этой схеме белок повторно растворяется в едком натре (при pH 12,0), затем осаждается в присутствии хлористого натрия при pH 10,0.
Полученный таким методом белок содержит 17,8% азота и лишь самое незначительное количество примесей: фосфора 0,021%, пентоз 0,067% (т. е. компонентов нуклеиновых кислот) и гексоз 0,25%.
Присутствующий в эндосперме в небольшом количестве проламин риса удаляется частично солевым раствором и водой, а на последней стадии очистки глютелина — 60% этанолом.
Для выяснения роли дисульфидных связей в молекуле глютелина его обработали β-меркаптэтанолом и освободившиеся SH-группы алкилировали для предотвращения их окисления. Электрофорез в полиакриламидном геле при разных значениях активной кислотности (pH 4,3; pH 5,0; pH 7,4) показал, что нативный глютелин остается на старте вследствие большого размера молекул. Восстановленный и алкилированный глютелин риса дает две четко выраженные полосы. Следовательно, молекула глютелина состоит не менее чем из двух типов субъединиц, прочно соединенных между собой дисульфидными связями.
Медленно мигрирующий в кислой среде компонент— нейтральный белок присутствует в большей концентрации, чем быстро мигрирующий белок основного характера.
Для препаративного получения обоих компонентов применяли ионообменную хроматографию на колонке CM — Сефадекс Г-50 с градиентом pH.
При этом были получены три фракции (рис. 16), из которых первая оказалась идентичной медленно движущейся при электрофорезе фракции, а вторая и третья — быстродвижущейся. Соотношение этих компонентов было 8:1:1. Обработка 1-фтор-2,4-динитробензолом первого компонента не позволила идентифицировать N-концевые аминокислоты этого белка; во втором и третьем компонентах, так же как и в исходном глютелине, был обнаружен только глицин в количестве 28,7 моль на 1 г белка. Определение аминокислотного состава исходного глютелина и его первого и третьего компонентов показало высокое содержание в них дикарбоновых аминокислот. Около 60% аминокислот находятся в форме амидов (табл. 21). Нейтральная, преобладающая количественно субъединица — первый компонент характеризуется значительно более низким содержанием лизина по сравнению со второй субъединицей. Определение молекулярной массы методом ультрацентрифугирования дало величину для первого компонента, равную 20 000. Это соответствует 179 остаткам аминокислот в полипептидной цепочке со следующим составом: Лиз4, Гис4, Apг13, Aсп16, Глю37, Гли15, Ала10, Вал11, Лей13, Илей7, Про6, Cep13, Tpe7, Цис4, Meт1, Тир6, Трипт2, Фе9 и амидный азот21.
Молекулярная масса третьего компонента, рассчитанная по количеству концевых аминогрупп, составляет около 43 000 со следующим составом: Лиз16, Гис9, Арг28, Асп47, Глю39, Гли22, Ала31, Вал31, Лей28, Илей22, Про16, Cep24, Tpe15, Цис4, Мет5, Tир16, Трипт2, Фе16 и амидный аммиак55.
Возможно, что слоистые белковые тела эндосперма риса состоят главным образом из глютелина и формируются именно из описанных выше субъединиц.
Таким образом, при общей молекулярной массе около 2 000 000 глютелин риса состоит из субъединиц молекулярной массы 20 000 и 43 000, соединенных между собой дисульфидными связями.