Глиадин и глютенин пшеницы
Белки глиадин и глютенин составляют основную часть клейковины, отмываемой из пшеничного теста. Характерной особенностью этих белков является их слабая растворимость в воде, обусловленная наличием гидрофобных групп на поверхности молекулы белка. Для перевода их в раствор применяют различные вещества. Некоторые из растворителей в различной степени денатурируют белок, разрушая не только слабые водородные, но и более сильные ковалентные связи, например дисульфидные связи макромолекулы.
Поэтому при исследовании белкового состава злаков необходимо всегда точно указывать, какие именно растворители применяли для извлечения этих белков.
Глиадин. Для него наиболее характерной особенностью является способность растворяться в водных растворах спиртов: этанола, метанола и других при концентрации спирта 60—70%. Именно на этом основании Осборн и выделил глиадин пшеницы и других культур в особую группу спирторастворимых белков — проламинов, наличие которых является признаком, отличающим зерно злаковых культур от семян растений других семейств.
Методы извлечения глиадина и получения его чистых препаратов можно разделить на две группы:
- извлечение непосредственно из муки или размолотого зерна повторной обработкой водным этанолом;
- извлечение белка из клейковины сырой или высушенной лиофильным способом.
В последнем случае растворителем служит также этанол или слабый раствор органической кислоты; наиболее часто применяют 0,05 M раствор уксусной кислоты. В кислый раствор переходит не только глиадин, но и глютенин, который затем отделяют от глиадина под действием этанола. Критическое рассмотрение всех вариантов выделения глиадина было дано ранее, поэтому здесь приводим ссылки на соответствующую литературу.
Если подходить к оценке этих методов с точки зрения получения наиболее чистых препаратов, то следует предпочесть непосредственное выделение глиадина из муки; при замесе муки с водой и последующем отмывании клейковины происходит взаимодействие белков с углеводами и липидами с образованием глико- и липопротеинов.
Следует отметить, что очень чистый глиадин можно получить из препаратов промежуточного белка — цвикельпротеина, извлеченных из пшеничной муки фракционированием топкоразмолотого продукта.
Из спиртовых растворов глиадин осаждается после удаления спирта под вакуумом или при добавлении ацетона,
Глиадин, растворенный в уксусной кислоте, осаждается после нейтрализации раствора: изоэлектрическая точка глиадина лежит, по данным разных авторов, в пределах pH 5,8-7,2. Применяется также лиофилизация кислых растворов глиадина, в результате которой уксусная кислота удаляется, и белок остается в виде сухого препарата. Содержание азота в глиадине, полученном разными способами, колеблется в пределах от 17,6 До 18,0%.
Такое отклонение объясняется не только тем, что данные препараты содержат различное количество белка, но и тем, что полученные белки не совсем идентичны по своему химическому составу.
Высушенный глиадин представляет собой бесцветный порошок, быстро поглощающий воду и образующий при этом клейкую массу, лишенную упругости и напоминающую по своей консистенции дефектную клейковину пшеницы, поврежденной клопом-черепашкой
Аминокислотный состав глиадина представлен в таблице 8 в сопоставлении с глютенином, альбумином и глобулином пшеницы.
Высокое содержание амидов дикарбоновых аминокислот (глютаминовой и аспарагиновой) характерно для клейковинных белков и проламинов других видов злаков. От альбуминов и глобулинов пшеницы и других злаков глиадин отличается также большим содержанием пролина и малым — лизина.
Выделенные из пшеничной муки или клейковины препараты глиадина не являются химически однородным белком, как в свое время предполагал Осборн. При применении разных методов он может быть разделен на фракции, различные по растворимости или по электрофоретической подвижности. С 1930 г., когда удалось получить три фракции глиадина, осаждающихся из этанола, и до настоящего времени накоплен большой экспериментальный материал, характеризующий неоднородность глиадина. По растворимости в этаноле оказалось возможным выделить две фракции глиадина: α- и β-глиаднн. Молекулярная масса первого равна 27000, он растворяется в 40%-ном растворе этанола, β-глиадин имеет молекулярную массу 47 000 и растворим только в 70%-ном растворе этанола. Изучение двух фракций глиадина, растворяющихся в этаноле разной концентрации, показало, что молекулы белков этих фракций различаются по вязкости спиртовых растворов и по величине осевого соотношения молекулы.
Методом постепенного насыщения растворов белка сульфатом аммония из глиадина было выделено несколько фракций.
Большие успехи в разделении глиадина нa фракции были достигнуты при использовании электрофореза в различных модификациях. Впервые в 1947 г. было доказано, что при электрофорезе глиадин может быть разделен по крайней мере на два компонента, которые, в свою очередь, не являются гомогенными, а состоят также из нескольких фракций. Затем при исследовании электрофореза глиадина в различных буферных смесях при разных pH и ионной силе растворов оказалось возможным получить четыре компонента. Они передвигаются в электрическом поле самостоятельно или же при ином составе среды способны образовывать комплексы, состоящие из двух и более компонентов.
При электрофорезе на бумаге в растворах при pH 2,81 и pH 11,0 в глиадиие также обнаружено четыре отдельных компонента.
В последующих работах глнадин пшеницы был разделен на пять фракций, обладающих разной электрофоретической подвижностью; электрофорез растворов клейковины в крахмальном геле обнаружил по крайней мере девять компонентов, из которых один, остающийся на старте, был идентифицирован как глютенин, а остальные восемь представляли собой фракции глиадина.
Электрофоретическая диаграмма глиадина пшеницы, на которой видно семь компонентов, представлена на рисунке 13. Электрофорез растворов белка в алюминиево-лактатном буфере pH 3,1 в крахмальном геле, содержащем 3М раствор мочевины, позволил разделить глиадин на 18—28 четко выраженных фракций, число и расположение которых является сортовым признаком.
При электрофорезе на полиакриламидном геле с мочевиной также обнаруживается 14—20 компонентов в спектре глиадина.
По величине электрофоретической подвижности глиадин пшеницы классифицируется на фракции, как это схематически показано на рисунке 14.
Каждая из этих фракций, в свою очередь, может состоять из нескольких компонентов, обозначаемых α1, α2 и т. д.; α-глиадииы были получены в чистом виде при примененин методов ультрацентрифугирования, гельфильтрации и электрофореза. Электрофорезом α-глиадин был фракционирован на два компонента α1 и α2. Последний при электрофорезе в щелочной среде разделяется на три компонента. В чистом виде были выделены также β-глиадины; полученные фракции имели одинаковую молекулярную массу и аминокислотный состав.
При разделении растворов белка методом хроматографии на колонках Сефадекс Г-100 или на полиакриламидном геле обнаружено несколько фракций. Они соответствуют аналогичным компонентам, полученным при электрофорезе. Комбинирование гельфильтрации и электрофореза позволяет получить препараты глиадина, гомогенные по составу.
Молекулярную массу глиадина определяли неоднократно различными методами. Полученные данные значительно варьируют в зависимости от степени чистоты препарата и от того, в какой среде проводили определение. В глиадине, полученном по методу Осборна, был обнаружен белок, имеющий молекулярную массу около 100000; по показателям аминокислотного состава, растворимости, вязкости растворов, констант диффузии и седиментации этот белок соответствовал низкомолекулярной фракции глютенина. Хроматографический анализ на колонке Сефадекс Г-100 удаляет эту примесь, причем получается чистый глиадин с молекулярной массой около 26000. Близкая к этой величине молекулярная масса глиадина была получена также при ультрацентрифугировании, если исключалось агрегирование молекул глиадина, в результате которого молекулярная масса белка сильно повышалась.
Так, по данным Войчика и Джонса с сотрудниками, молекулярная масса γ-глиадина лежит в пределах 26 000—37000. По данным Гюбнера, Ротфусса и Уолла, молекулярная масса его значительно меньше (16000—18000). Более высокие значения молекулярной массы получены Бернардеиом, Казарда и Мичемом для α-глиадина (49 000—55 000).
Применение нового метода электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии меркаптэтанола (для разрыва дисульфидных связей) и додецил-сульфата натрия позволило фракционировать α-, β- и γ-глиадин, полученные методом гельфильтрации, на некоторые компоненты молекулярной массой от 32 000 до 36000. Аминокислотный состав этих фракций представлен в таблице 17. Во фракции α-глиадина обнаружено при электрофорезе шесть полос с молекулярной массой от 30000 до 75 000. При этом преобладали фракции с молекулярной массой 32 000—36000.
Во фракции β-глиадииа обнаружено три главных компонента с молекулярной массой от 36000 до 44 000. Определение содержания цистина показало, что на одну молекулу белка приходится как минимум четыре дисульфидные связи. Фракция γ-глнадина состоит из двух главных компонентов и нескольких меньших; молекулярная масса первых равна 38 000 и 44 000.
Восстановление глиадина не оказывает значительного влияния на его молекулярную массу и вязкость растворов. Некоторое снижение вязкости неочищенного глиадина объясняется присутствием в нем фракции низкомолекулярного глютенина. При разрыве дисульфидных связей глиадина изменяется форма его молекулы; это свидетельствует о том, что в глиадине дисульфидные связи являются внутримолекулярными (табл. 18).
Следует отметить, что, по новейшим данным, при обработке глиадина β-меркаптэтанолом и последующем окислении может происходить конверсия внутримолекулярных связей в межмолекулярные, с соответствующим увеличением молекулярной массы белка.
В работах, недавно проведенных, вновь был пересмотрен вопрос о молекулярной массе глиадина. Раствор его был разделен на колонке Сефадекс Г-100 на три фракции: ω-глиадин, γ-глиадин и смесь α- и β-глиадинов.
Молекулярную массу этих фракций определяли двумя методами: электрофорезом в растворе додецил-сульфата натрия в полиакриламидном геле по скорости передвижения сравнительно с белками известной молекулярной массы и методом седиментационного равновесия. При электрофорезе ω-глиадин дал три компонента молекулярной массой — 50 000, 54 000 и 64 000; γ-глиадин — два компонента молекулярной массой — 38000 и 46000, а α- и β-глиадины — два компонента молекулярной массой—33000 и 38000, Метод седиментации показал однородность всех трех фракций по молекулярной массе и дал следующие величины: для γ-глиадина — 28000, для ω-, α- и β-глиадииа — 27000. По-видимому, в процессе электрофореза в растворе додецил-сульфата натрия происходит агрегирование молекул белка.
Концевые аминокислоты глиадина, так же как и последовательность чередования аминокислот в полипептидной цепочке, изучены еще мало. Данные по N- и С-концевым группам обобщены в обзорах.
Глютенин. Выделение из пшеничной муки глютенина методом Осборна, т.е. растворением в щелочи, в значительной степени денатурирует его, как это было показано многими исследователями, Поэтому в настоящее время глютенин извлекают при растворении белков в смеси слабой органической кислоты с 70%-ным раствором (метод Блиша). При последующей нейтрализации щелочью глютенин выпадает в осадок, а в растворе остается глиадин.
Повторным растворением в кислоте и переосаждением можно получить чистые препараты глютенина, содержащие 17,0%) азота.
В настоящее время предложен эффективный способ получения чистых препаратов глютенина экстракцией пшеничной муки смесью уксусной кислоты, мочевины и гексадецил-триметил-бромида аммония.
При обработке этим растворителем из муки извлекается 98% всего белка. Методом гельфильтрации из этой смеси можно получить чистый глютенин. В более поздних работах данные о почти полной растворимости белков пшеничной муки в указанном растворителе не были подтверждены. Наибольшее количество извлекаемого белка составляло 72%. По-видимому, на величину растворимости влияют и нативные индивидуальные свойства белков. В последующем изложении этот вопрос будет рассмотрен более подробно.
Сухой препарат глютенина быстро поглощает воду, образуя сильно гидратированный гель, отличающийся от глиадина и клейковины тем, что он не способен растягиваться и обладает определенной упругостью.
Глютенин, имея широкий спектр молекулярной массы (от 100 000 до нескольких миллионов), является весьма гетерогенным. Так как у глютенина большая молекулярная масса, он при электрофорезе не диффундирует в гель и остается на старте. При обработке глютенина различными восстановителями (сульфит натрия, этилмеркаптан) его молекулярная масса сильно понижается; он расщепляется на гомогенные частицы с молекулярной массой, равной 20 000, диффундирующие в крахмальный гель, в отличие от исходного белка. Продукты восстановления глютенина лишены упругости. Эти данные позволяют предположить, что дисульфидные связи глютенина являются межмолекулярными и соединяют полипептидные цепи молекулярной массой 20 000 в молекулы белка массой в 1,5— 2,0 млн.
В дальнейших исследованиях глютенин восстанавливали меркаптэтанолом в присутствии гуанидингидрохлорида и додецилсульфата натрия. При электрофорезе полученных продуктов было обнаружено около 20 фракций, часть которых была только в виде слабых следов. Характеристика компонентов представлена в таблице 19, из которой видно, что молекулярную массу около 20 000 имеют только те субъединицы глютенина, которые находятся в продуктах его восстановления в виде следов. Основные компоненты глютенина пшеницы, а также ржи и ячменя характеризуются более высокой молекулярной массой — 41 000—44 000. Следует отметить, что контрольный, т. е. невосстановленный глютенин, при электрофорезе в основном остается на старте, но некоторые фракции передвигаются в геле (они имеют молекулярную массу от 90000 до 150000). В восстановленном глютенине фракции с такой молекулярной массой отсутствуют. В контрольном глютенине обнаруживаются также фракции с молекулярной массой от 8000 до 90 000, представляющие собой, вероятно, белки типа глобулинов и альбуминов, сорбированные глютенином при его выделении.
В этих же исследованиях проводилось определение дисульфидных связей в молекуле глютенина. Большая часть полипептидных цепей глютенина пшеницы и некоторых других злаков содержит две S—S-связи; у глютенина ячменя по две лабильных—S—S-связи имеет меньше половины всех полипептидов. Глютелин сорго состоит из небольшого числа полипептидных цепей, каждая из которых имеет только одну дисульфидную связь.
Представляют интерес данные, полученные в опытах воздействия ультразвука разной частоты на растворы клейковины. При обработке растворов ультразвуком частотой 23—776 кГц были заметны явно выраженные изменения в соотношении различных компонентов клейковинных белков. При гельфильтрации на Сефадекс Г-100 после воздействия ультразвука полностью исчезала или резко уменьшалась фракция I, соответствующая наиболее высокомолекулярным белкам (глютенину). При электрофорезе в крахмальном геле как исходного раствора, так и отдельных фракций, полученных при гельфильтрации, обнаружены новые быстродвижущиеся компоненты (рис. 15). Эти данные свидетельствуют о том, что при воздействии ультразвука происходит деполимеризация молекул белка, в том числе глютенина. Дальнейшее изучение этого явления позволит, несомненно, получить новые данные о структуре глютенина.
Некоторые авторы высказывают предположение, что глютенин и глиадин представляют собой один и тот же белок, а имеющиеся между ними различия в электрофоретической подвижности и растворимости обусловлены более высокой степенью полимеризации глютенина. Иначе говоря, предполагается, что молекула глютенина состоит, по крайней мере частично, из глиадиноподобных субъединиц, соединенных между собой дисульфидными связями. Основанием для этого предположения послужил тот факт, что при восстановлении молекул глютенина получаются субъединицы, похожие на глиадин. Полимеризация глиадина при обработке его глютаровым альдегидом повышает молекулярную массу белка, и его поведение при электрофорезе становится похожим на поведение глютенина.
Присутствие в глиадине и глютенине идентичных полипептидных цепей было недавно показано сопоставлением пептидных карт трипсиновых гидролизатов этих белков. Дальнейшими работами, в которых были изучены гидролизаты, полученные при обработке глютенина и глиадина протеолитическим ферментом проназой, установлено, что в этих белках содержатся пептиды, как идентичные, так и различные по аминокислотному составу и молекулярной массе.
Данные иммунохимического анализа глиадина и глютенина интерпретируются по-разному. В начальных исследованиях, этого вопроса был сделан вывод, что компоненты обоих белков, обладающие антигенными свойствами, имеют близкую, но не тождественную структуру. По мнению других исследователей, наличие реакции идентичности глиадина и глютенина, растворенных в ЗМ растворе мочевины, подтверждает гипотезу о том, что глютенин является полимером глиадиновых компонентов.
Экспериментальные материалы показывают, что выделенный гельфильтрацией на Сефадекс Г-200 глютенин дает реакцию преципитации не только с антиглютениновой, но и с антиглиадиновой сывороткой и с сывороткой на растворимые белки. Поэтому можно сделать вывод, что глютенин не является самостоятельным индивидуальным белком, а представляет собой сложную ассоциацию большого количества разнородных молекул глиадина, альбумина и глобулина.
В работах, проведенных в последнее время, были подробно изучены свойства субъединиц глютенина, полученных при его восстановлении и блокировании сульфгидрильных групп разными способами: обработкой аминоэтилом, пиридэтилом или цианэтилом. Полученные производные глютенина частично растворялись в 70%-ном растворе этанола и имели молекулярную массу около 44 000, т. е. обладали свойствами, близкими к свойствам глиадина. Нерастворимая в 70%-ном растворе этанола фракция восстановленного глютенина значительно отличается от спирторастворимой по своему аминокислотному составу и состоит из субъединиц большой молекулярной массы.
Эти данные также подтверждают предположение о том, что глиадин и глютенин, выделенные из муки или клейковины, представляют собой компоненты единого целого, искусственно разделенные воздействием различных растворителей. Ho, конечно, необходимо провести еще дальнейшую экспериментальную работу для выяснения этого сложного вопроса.
При повторном экстрагировании пшеничной клейковины или муки 0,01 M раствором уксусной кислотой в остатке всегда находится некоторое количество нерастворимого белка. Для выяснения, из каких компонентов состоит этот белок, были проведены специальные исследования. При обработке этого остатка диметиламиноэтанолом оказалось возможным перевести в раствор около 85% находящегося в нем белка. Хроматография на колонках с агарозой позволила выделить из него две высокомолекулярные фракции, одна из которых при электрофорезе не мигрировала в крахмальный гель, подобно глютенину.
После восстановления 0,3 M раствором меркаптэтанола в 8M растворе гуанидингидрохлорида при pH 8,0 и алкилировании акрилинтритом эта фракция при электрофорезе была идентифицирована как глютенин. Вторая фракция при электрофорезе дала полосы, аналогичные по положению γ-глиадину; восстановление и алкилирование обнаружило в ней также глютенин и белок, передвигающийся быстрее.
При применении 70%-ного раствора хлорэтанола в 0,1 н. растворе HCl оказалось возможным перевести в раствор 93% всего белка, оставшегося после экстрагирования клейковины уксусной кислотой. Электрофорез раствора позволил обнаружить медленно движущиеся фракции, подобные глютенину, наряду с быстро передвигающимися белками. После восстановления и алкилирования белки давали при электрофорезе компоненты, аналогичные восстановленным водорастворимым белкам, Аминокислотный состав фракции белка, нерастворимой в уксусной кислоте, также был ближе к альбумину, чем к глютенину.
Таким образом, можно предположить, что нерастворимая фракция представляет собой сложную смесь высокомолекулярных белков.
Некоторые белки построены из полипептидов, соединенных межмолекулярными дисульфидными связями.