Медьсодержащие белковые вещества

28.10.2014

Существенный практический интерес представляют еще очень мало изученные белковые вещества, хорошо растворимые в воде и содержащие медь. При изучении качества макаронных изделий было установлено, что некоторые сорта твердой пшеницы дают макароны неприятно коричневого цвета, резко отличающегося от нормального кремового. Опыты показали, что при обработке водой крупок, из которых получают коричневые макароны, можно извлечь коричневый пигмент. В результате макароны становятся значительно светлее. Далее было проведено исследование водных вытяжек крупок, дающих изделия нормального и коричневого цвета. Последние имели красно-коричневый цвет. Сопоставление его с цветом продуктов окисления β-крезола тирозиназой и цветом продуктов реакции Майара обнаружило, что коричневые пигменты имеют совершенно иные спектры поглощения, чем продукты, перечисленные первыми. Коричневый пигмент имеет максимум поглощения при длине волны 400 нм и второй максимум, типичный для белковых веществ, в пределах 280 нм. Общее содержание белка в пигментах, выделенных из крупок, оказалось около 70%. Определение меди в полученных белковых препаратах обнаружило высокое содержание ее в крупках, дающих изделия коричневого цвета, и во много раз меньшее — в крупках нормального качества, дающих изделия белого и кремового цвета.
Анализ белковой фракции выделенного пигмента показал высокое содержание в нем аминокислот лизина, гистидина и аргинина, что видно из следующих данных.

Особое место среди белков пшеницы занимает пуротионин — своеобразный белок, растворимый в петролейном эфире и способный кристаллизоваться. Специфической особенностью его является способность ингибировать спиртовое брожение и размножение дрожжевых клеток. Пуротионин, выделенный из пшеничной муки, по-видимому, представляет собой липопротеин, липидная фракция которого может быть удалена гидролизом. Исследования показали, что пуротионин, содержащийся в количестве 0,03% от массы муки, электрофорезом в крахмальном геле и хроматографией на колонке с Сефадекс Г-75 может быть разделен на две фракции: А и В, отличающиеся по аминокислотному составу, Фракция В характеризуется особенно высоким содержанием цистина и близка к глобулину, извлекаемому из муки 1M раствором хлористого натрия. Молекулярная масса ее приближается к 10 000, при электрофорезе эта фракция движется наиболее быстро. Восстановление α-пуротионина и последующий электрофорез в крахмальном геле подтвердили, что этот белок построен из одной полипептидной цепочки.
При окислении восстановленного пуротионина в слабых растворах вновь образуется его исходная структура; если же окисление проводится в концентрированных растворах, то интенсивно образуются внутримолекулярные поперечные связи,
Исследование пуротионина в других видах пшеницы (Тr. durum. Тr. monococcum) показало, что в зерне последней присутствует только пуротионин В; в зерне Aegilops Speltoides, A. Squarrosa и других видах этого злака синтезируется только пуротионин А. В отношении этого белка обнаруживается видовая специфичность.
Из зерна ячменя также оказалось возможным извлечь белок, аналогичный пуротионину, что еще раз доказывает близость этих двух злаков.
В отличие от пшеницы эндосперм ржи характеризуется очень высоким содержанием альбуминов (см. табл. 9); значительно больше в нем также и глобулинов. Следует отметить, что в водную вытяжку переходит некоторое количество глиадина, а также гликопротеин (по аналогии с пшеницей).
Методом гельфильтрации на колонках с Био-Гель Р-150 альбумины ржи разделяются не менее чем на четыре фракции. Первая из них содержит высокомолекулярные белки массой около 80000—90000; при электрофорезе в полиакриламидном геле почти вся она остается на старте и только небольшое количество слабо выраженных полос обнаруживается в геле. По-видимому, эти белки представляют собой глиадин. Во фракциях II—IV содержатся низкомолекулярные белки, массой в пределах от 6000 до 14000, что соответствует альбуминам. При электрофорезе они дают две главных и семь меньших полос. Глобулины ржи также весьма неоднородны; гельфильтрация разделяет их на три фракции с молекулярной массой около 150 000 (пик I), 20000 и 8000. Электрофорез в полиакриламидном геле позволяет выделить всего восемь различных глобулинов.
Альбумины и глобулины кукурузы изучены еще очень мало. В основном они сосредоточены в зародыше, причем альбумины составляют около 85%. Наилучшим растворителем для них является 0,5 M раствор хлористого натрия; однако в экстрактах, кроме альбуминов и глобулинов, обнаруживается и некоторое количество углеводов. Выделенные диализом фракции обнаруживают значительную гетерогенность при электрофорезе и гельфильтрации.
Альбумины и глобулины заметно отличаются друг от друга по количеству и интенсивности полос на электрофореграмме; для альбуминов как зародыша, так и эндосперма характерны две темные широкие полосы; глобулины обнаруживают близко расположенные, но четко выраженные четыре полосы и одну полосу белка с высокой электрофоретической подвижностью. Различия между альбуминовыми фракциями разных частей зерна выражены менее резко и проявляются в присутствии нескольких дополнительных полос быстро движущегося белка зародыша.
Данные аминокислотного состава альбуминов и глобулинов кукурузы приведены в таблице 14.

Наибольшие различия в альбуминовой фракции выражаются в низком содержании пролина в белке зародыша. Следует отметить, что в отличие от белков других культур высушенные лиофильной сушкой альбумины и глобулины кукурузы очень плохо растворяются в солевых растворах.
Возможно, что в данном случае окисляются сульфгидрильные группы и образуются дисульфидиые связи между молекулами белка; однако экспериментальных данных нет.
Гетерогенность альбуминовой фракции зародыша кукурузы отмечалась всеми авторами, изучавшими эти белки.
Из глобулинов других злаков наиболее обстоятельному изучению были подвергнуты белки риса, извлекаемые солевыми растворами. Исследования показали, что наибольшее количество их находится в зародыше, где они составляют почти половину всех белковых веществ. Полученные экстракцией 0,5M раствором хлористого натрия и последующим диализом препараты глобулинов (особенно зародыша) риса содержат значительную примесь нуклеиновых кислот. Для их удаления необходимо применить фракционное осаждение сернокислым аммонием. Очищенные таким образом глобулины метолом гельфильтрации и ультрацентрифугирования разделяются на несколько компонентов, обозначаемые как α-, β- и γ-глобулины, различающиеся по своей молекулярной массе. В зародыше риса количественно преобладают γ-глобулины, в эндосперме и периферийных слоях зерновки (включая алейроновый слой) присутствуют α- и β-глобулииы.
Учитывая особый интерес, который представляет γ-глобулин в связи с его физиологической функцией в зародыше, в дальнейшем очень подробно изучалась именно эта фракция глобулинов. Ультрацентрифугирование показало гомогенность γ-глобулииа, но электрофорез в полиакриламидном геле (pH 8,35 и ионная сила 0,11) обнаружил по крайней мере два компонента этого белка. Неоднородность v-глобулина заметна также и при гельфильтрации на Сефадекс Г-200.

Использование метода ионообменной хроматографии (колонки с ДЭАЭ-целлюлозой — Сефадекс А-50) позволило выявить три компонента; γ1-, γ2- и γ3-глобулина (рис. 12). Каждый из них при исследовании методами электрофореза и ультрацентрифугирования проявил себя как вполне гомогенный. Молекулярная масса γ1-глобулина была определена методом ультрацентрифугирования и оказалась равной 200 000+10 000, коэффициент седиментации 7,26 S. Характеристическая вязкость составляла 0,0424 dl/n, осевое соотношение молекулы равнялось 14, что указывает на очень четко выраженную эллипсоидовидную форму молекулы.
Данные аминокислотного состава глобулина представлены в таблице 15. Следует отметить, что в состав молекулы γ-глобулина риса входят 18 остатков гексоз, три остатка пентоз, шесть остатков гексозамина. Из 1751 остатка аминокислот в нем находится Лиз58, Гис47, Арг148, Асп126, Глю273, Гли161, Ала144, Baл121, Лей106, Илей72, Про83, Сер136, Tpe48, Гип68, Цис17, Meт16, Тир44, Трипт6, Фе75 и амидного аммиака163.

N-концевыми аминокислотами являются аргинин, глютаминовая кислота, фенилаланин, лизин и глицин, количественные соотношения которых представлены в таблице 16.

Из данных, приведенных в таблице 16, следует, что молекула γ1-глобулина состоит из десяти субъединиц, т. е. полипептидных цепей. Для выяснения природы связей, обусловливающих получение подобной четвертичной структуры, провели определение констант седиментации, а также электрофорез нативного глобулина и после обработки его 8М раствором мочевины, S-цианоэтилом или β-хлормеркуробензойной кислотой. Если нативный белок имел константу седиментации, равную 7,26 S, соответствующую молекулярной массе белка 200 000, то при растворении в 8М растворе мочевины происходит диссоциация его на субъединицы, с понижением константы седиментации до 1,9 S. Она соответствует молекулярной массе белка, равной 20000, т. е. одной десятой части исходной массы. Полученные данные подтверждают результаты определения количества N-концевых аминокислот, равного десяти на одну молекулу белка.
Обработка белка реактивами, разрывающими дисульфидные связи, не изменяет его электрофореграммы, на которой видно восемь полос. Это говорит о том, что присутствующие в молекуле γ1-глобулнна три дисульфидные связи являются внутримолекулярными, следовательно, они не принимают участия в ассоциации субъединиц в макромолекулу. Вероятно, в образовании последней, кроме водородных связей, участвуют также и гидрофобные.