Протеолитические ферменты
Несмотря на то что технологическая роль ферментов, расщепляющих белковые вещества злаков, весьма значительна, исследованиям этой группы ферментов в последние годы уделяют меньше внимания, чем изучению, например, α- и β-амилазы. Возможно, это объясняется трудностями определения степени их воздействия на субстрат, с одной стороны, и неопределенностью к какой из известных групп протеолитических ферментов отнести протеазы пшеницы, с другой стороны.
Основной вывод, который можно сделать из ранее опубликованных материалов, заключается в том, что собственно гидролитическая активность протеолитических ферментов нормального по качеству зерна злаков невелика. Поэтому такие классические методы определения активности пептид-гидролаз (3.4) вообще и пептил-пептидгидролаз (3.4.4) в частности, как титрование освобождающихся при гидролизе пептидных связей аминных или карбоксильных групп, мало что дают при попытке оценить возможное технологическое значение этих ферментов. Прирост этих групп в автолизатах пшеничной муки весьма незначителен и не связан с изменением свойств клейковины, отмечаемым за этот же период.
Именно поэтому рядом авторов было предложено учитывать активность протеаз зерна и муки по количеству переходящего по мере автолиза в водный раствор азота, фракционируя его на белковый и небелковый.
Наиболее эффективно этот метод был применен в серии работ, посвященных роли протеолиза в определении хлебопекарных свойств пшеничной муки. При использовании в качестве реактива для разделения продуктов распада белков трихлоруксусной кислоты и гидрата окиси меди было установлено, что при автолизе пшеничной муки с клейковиной различного качества прирост не осаждаемого реактивом Барнштейна азота был очень незначителен во всех образцах; количество же растворимых в воде первичных продуктов распада белка, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой, закономерно и значительно повышалось и тем сильнее, чем более разжижалась клейковина данного образца. Естественно, что при автолизе повышалось и общее количество растворимых азотистых соединений.
Накопление продуктов первичного распада белковых веществ при автолизе муки коррелировало со скоростью распада отмытой из теста клейковины.
Исследование большого количества образцов пшеничной муки со слабой, средней и крепкой клейковиной позволило показать, что по накоплению водорастворимых азотистых веществ, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой, можно в определенной степени характеризовать технологические свойства муки; слабая, разжижающаяся клейковина соответствует наибольшему количеству продуктов распада белков, переходящих в водную вытяжку при автолизе мучной болтушки.
Наряду с этим исследование разжижающейся клейковины муки, полученной из проросшего зерна, или из зерна, пораженного клопом-черепашкой, показало, что в данном случае полная деградация клейковины наступает задолго до того, как обнаруживается повышение содержания водорастворимого белкового или тем более небелкового азота. На основании этих материалов и было высказано предположение о существовании в зерне злаков специальных ферментов, дезагрегирующих молекулу белка без разрыва пептидных связей.
Изложенные выше данные о структуре белковых веществ злаков, и в особенности глютенина, дают основание предполагать, что существенную роль в определении реологических свойств клейковины играют дисульфидные мостики, соединяющие полипептидные цепи в макромолекулу белка. Об этом свидетельствует изменение молекулярной массы глютенина под влиянием восстановителей и соответствующее изменение реологических свойств клейковины, наблюдаемое под воздействием этих же веществ, Естественно было предположить и существование специальных ферментов, расщепляющих S—S-связи.
В зародыше пшеницы была обнаружена глютатионредуктаза, восстанавливающая окисленный глютатион в присутствии ряда компонентов: НАДФ или НАДФН. Более подробное исследование этого фермента показало, что активность его сильно повышается при прорастании зерна, как это видно из нижеприведенных данных.
Проведенный одновременно анализ прорастающего зерна показал, что в последнем по мере прорастания накапливаются низкомолекулярные тиоловые соединения, которые могут быть обнаружены в фильтрате после осаждения белковых веществ. По-видимому, глютатионредуктаза оказывает воздействие не только на глютатион собственно, но и на белковые вещества, восстанавливая дисульфидные связи с образованием низкомолекулярных продуктов. Возможность существования такого механизма воздействия показана в отношении фермента протеиндисульфидредуктазы семян гороха (1.6.4.4.). Этот фермент в присутствии восстановленного НАДФ и соответствующего белкового вещества восстанавливает дисульфидные связи последнего. Активность его, как показали исследования, также сильно повышается при прорастании семян.
Сопоставляя все имеющиеся данные об изменении реологических свойств белковых веществ при разрыве дисульфидных межмолекулярных связей с необычайно быстрым изменением клейковины проросшего зерна или зерна, поврежденного клопом-черепашкой, можно предположить, что в этих случаях наблюдается один и тот же механизм расщепления макромолекулы. Разжижение клейковины под влиянием концентрированных препаратов ферментов проросшего зерна происходит без одновременного изменения в содержании растворимого белка, во всяком случае, без повышения количества небелкового азота. Отсюда вытекает необходимость дальнейшего проведения исследований ферментативного изменения белковых веществ клейковины. Изучать этот вопрос нужно не в аспекте классических протеиназ, гидролизующих пептидные связи, а в направлении поисков других возможностей, в частности изучения протеиндисульфидредуктаз. Эти исследования на основе применения современных методов определения структуры белковых веществ могут способствовать разрешению сложнейших проблем протеинологии, представляющих огромный теоретический и практический интерес.