Определение ядовитых свойств зерна, перезимовавшего в поле

11.07.2015

Разработке методов определения токсических свойств зерна, перезимовавшего в ноле, было посвящено много работ. Сравнительный анализ нормального и токсического зерна привел исследователей к заключению, что органолептические показатели, а также проба на всхожесть не могут быть в данном случае достаточными.
Имеются указания, что перезимовавшему в поле зерну свойственны блеклость, щуплость, ломкость, трухлявость, легковесность и окрашенность («чернолаковые» зерна). Эти признаки не постоянны и их можно использовать лишь как вспомогательные.
Однако можно считать твердо установленным, что вытяжки (водная, эфирная, спиртовая) из явно неблагополучного зерна обладают токсическими свойствами. Наиболее ядовитой оказалась фракция, содержащая жирные кислоты и переходящая в этиловый спирт (В.Л. Kpeтович).
Для выявления вредных свойств веществ, переходящих из зерна в вытяжки, был рекомендован ряд биологических проб. Наиболее часто применяется кожная проба, рекомендованная А.X. Саркисовым. Она основана на том, что токсические вещества вызывают на коже кролика ясно выраженный воспалительный процесс с последующими некрозами на месте нанесения вытяжки. Для этой пробы обычно берется эфирная вытяжка.
О.К. Элпидина показала, что присутствие токсических веществ в перезимовавшем зерне можно установить с помощью растений. Если в водный экстракт токсического зерна опустить черешками листья каких-либо растений (томата, фуксии, клевера, картофеля и т. д.), то через несколько часов они вянут. Сильно токсичное зерно вызывает увядание растений через 5—6 часов, слабо токсичное — через 55—60 часов. Этот метод расценивается автором как предварительный.
Токсические свойства зерна могут быть испытаны на простейших. Co всеми перечисленными методами можно познакомиться по книге Н.А. Спесивцев ой «Микозы и микотоксикозы животных» и другим руководствам. Здесь будет описан лить микробиологический метод определения токсических свойств зерна, который был предложен Е.Н. Мишустиным, разработавшим его в сотрудничестве с биохимиками (Б.Л. Кретович и А.А. Бундель). Этот метод основан на способности токсических веществ перезимовавшего в поле зерна подавлять спиртовое брожение. Порядок проведения бродильной пробы описывается ниже.
Вначале готовят спиртовую (этаноловую) вытяжку из зерна. Опыты В.Л. Кретовича и его сотрудников показали, что при экстрагировании масла из токсического зерна этанолом даже при 10—12° токсическое начало целиком переходит в вытяжку. Спиртовая вытяжка испытуемого зерна обычно приготовляется путем двукратного одночасового настаивания 15 г свежеразмолотого зерна с 30 мл чистого этилового спирта (96 %) при комнатной температуре. Полученный экстракт выпаривается в чашке досуха ка водяной бане, и остаток используется для опытов в виде раствора в спирте. После удаления растворителя полученный экстракт имеет вид густой коричневой мази. Из нее готовится 2—2,5%-ный или 10%-ный раствор на чистом этиловом спирте. Взвешенный на часовом стекле экстракт смывается слабо подогретым спиртом в пробирочку. Объем спирта рассчитывают исходя из веса выпаренного осадка. Если вещество сразу не удалось смыть положенной дозой спирта, то тот же самый спирт повторно используют для растворения.
Полученный этаноловый экстракт вытяжки из исследуемого зерна используется для постановки бродильной пробы. Она весьма специфична и не дает положительной реакции при испытании хозяйственного негодного, но не ядовитого зерна. По заключению А.X. Саркисова, показания бродильной пробы весьма близки к кожной реакции.
Бродильная проба может быть осуществлена двумя способами. Первый, условно называемый «нормальным» вариантом бродильной пробы, прост R выполнении, но дает ответ не ранее 40—48 часов после постановки опыта. При помощи второго способа (так называемой «экспрессной бродильной пробы») ответ может быть получен через несколько часов после постановки опыта. Последний вариант требует более точной работы.
При работе по «нормальному» варианту используется 2—2,5%-ный раствор экстракта в винном спирте, а при использовании «экспрессной» пробы применяется 10%-ный раствор экстракта в том же растворителе.
Б качестве тест-объекта берутся дрожжи XII расы. Можно взять свежие прессованные дрожжи заводского приготовления. Чистая культура дрожжей может быть получена в любом микробиологическом учреждении.
При использовании «нормального» варианта бродильной пробы суспензия дрожжей, содержащая около 10 млн. клеток на 1 мл, готовится на физиологическом растворе. Б лаборатории удобно из каолина или какого-либо другого минерального вещества приготовить постоянный стандарт, по мутности которого можно делать дрожжевую суспензию. Конечно, первый раз количество содержащихся в суспензии клеток приходится устанавливать при помощи подсчета под микроскопом (следует использовать аппарат для счета кровяных шариков),
По 1 мл дрожжевой суспензии, приготовленной таким способом, вносят затем в небольшие колбы, содержащие 20 мл неохмеленного стерильного пивного сусла (7° по Баллингу). Вместо сусла можно брать какую-либо другую среду, на которой дрожжи энергично и быстро образуют газ. После разбавления дрожжевой суспензии на 1 мл среды будет приходиться около 0,5 млн дрожжевых клеток. Небольшие отклонения в ту или другую. сторону значения не имеют.
Кроме дрожжей, в колбы вносят испытуемый материал в виде спиртового раствора. Испытуемым материалом является спиртовая вытяжка зерна, рецепт приготовления которой был описан выше. В колбу вносится 2 мл. 2—2,5%-ного раствора экстракта. После этого общий объем содержимого колбочки увеличивается до 23 мл (20 мл среды, 1 мл суспензии дрожжей и 2 мл спиртового раствора испытуемого экстракта). Часть материала, содержащегося в спирте, после его смешения со средой выпадает в осадок, отчего среда делается мутной.
В контрольную колбу добавляют экстракт, полученный из заведомо нормального зерна, в остальные колбочки — из испытуемого материала. При постановке контрольного опыта заменять экстракт из нормального зерна чистым спиртом не рекомендуется, так как спирт извлекает из зерна вещества, влияющие на энергию брожения.
Нетрудно рассчитать, что после добавления спиртового раствора испытуемого вещества в питательную среду, содержание спирта в ней составит около 8,7%, а экстракта — около 0,17—0,2%. Высокая концентрация спирта создает условия, препятствующие размножению сапрофитных микроорганизмов в среде, поэтому все работы можно проводить и в нестерильных условиях. Сусло или другую среду следует обязательно хранить и употреблять для опыта в стерильном состоянии. Посуду для опыта (колбы, пинетки, воронки и т. д.) можно брать не стерилизованную. а чисто промытую.
Помимо подавляющего действия на сапрофитную микрофлору, высокая концентрация спирта обеспечивает хорошую растворимость ядовитых веществ и их быстрое проникновение в дрожжевую клетку.

После всех указанных операций общий объем жидкости в колбочке, которая служит для смешения будет равен 23 мл. Жидкость разливают пипеткой в 3—4 трубочки Дунбара (рис. 59) таким образом, чтобы запаянное колено было полностью заполнено жидкостью, а открытое — только частично. Открытое колено трубочки Дунбара должно быть градуировано. На заполнение одной трубочки идет обычно 5—6 мл среды.
Заполненные трубочки помещают в штативы, которые ставят в термостат при температуре 25—30° С.
Отсчет образовавшегося газа производят через 40—48 часов после начала опыта. Обычно в контрольных пробирках к этому сроку все запаянное колено бывает заполнено газом. При наличии ядовитого экстракта газа совсем не образуется пли образуется значительно меньше, чем в контроле.
Пo силе угнетения газообразования можно судить о степени токсичности зерна. Каждый опыт обычно ставят в трех-четырех повторностях и из полученных данных вычисляют среднее арифметическое.
Результат опыта желательно выражать в мл выделившегося углекислого газа.
При «экспрессном» варианте бродильной пробы используются очень густые суспензии дрожжей, вызывающие быстрое образование углекислого газа из сбраживаемого сахара.
Дрожжи обрабатываются концентрированными растворами испытуемых экстрактов. Если в спиртовых вытяжках имеются токсические вещества, то это вызывает быстрое отравление дрожжевых клеток.
Работу проводят при допустимо высоких для дрожжей концентрациях спирта, что обеспечивает энергичную диффузию ядовитых веществ в их клетки. Так как в растворах, содержащих высокий процент спирта, дрожжи могут быть убиты, то обработка дрожжей спиртовым экстрактом зерна проводится в течение строго определенного промежутка времени. После этого дрожжи сильно разводят питательной средой и разливают в трубочки Дунбара, которые помещают в термостат при температуре 25° С.
Дрожжи, обработанные экстрактом, который не содержит токсических веществ (спиртовой вытяжкой нормального зерна), не теряют своей бродильной способности, и через 3—4 часа образуют в запаянном колене несколько мл газа. Вытяжка сильно ядовитого зерна полностью подавляет брожение. При зерне средней токсичности брожение подавляется частично.
Все описанные операции проделываются в следующем порядке.
Из свежих прессованных дрожжей или из чистой культуры приготовляют на физиологическом растворе дрожжевые суспензии, содержащие 2—2,5 миллиарда дрожжевых клеток. Получается весьма густая болтушка из дрожжей. (При определении в ней количества клеток при помощи счетной камеры или нефелометра суспензию разводят в 50—100 раз.) Небольшие отклонения в густоте дрожжевой суспензии от указанной нормы практического значения не имеют.
После того, как проверена плотность суспензии 2 мл ее помещают в небольшую колбочку или пробирку и туда же добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора испытуемой спиртовой вытяжки. При приготовлении последней взятая на часовое стекло навеска экстракта смывается одним и тем же объемом спирта до тех пор, пока не перейдет полностью в раствор.
Полученную смесь энергично взбалтывают и оставляют в термостате при 25° на 1 час, в течение которого периодически взбалтывают. Это обеспечивает быстрое проникновение токсических веществ в клетки дрожжей.
В качестве контроля используют спиртовой экстракт па заведомо нормального зерна.
По истечении часа объем жидкости в опытных колбочках доводится до 20 мл, т. е. к ним добавляется 17,5 мл неохмеленного пивного сусла или другой питательной среды. Питательная среда для разбавления дрожжей должна быть прогрета до 30° С, чтобы после разбавления брожение могло начаться сразу же.
Затем разбавленные до 20 мл дрожжи разливают в три-четыре бродильные трубки Дунбара и ставят в штативах в термостате при температуре 25° С. Через три-четыре часа производят учет выделившегося газа. Как уже отмечалось в контрольных трубочках выделяется к этому сроку довольно много газа, а в трубочках, наполненных средой с экстрактом из токсичного зерна, брожение подавляется полностью или частично.
Экспрессный вариант бродильной пробы следует применять в случаях, требующих срочного решения. Полученные данные целесообразно считать предварительными.
В последнее время выполнен ряд работ, в которых была поставлена цель использовать для определения токсических свойств зерна иммунобиологические реакции. Еще в 1946 г. З.И. Алисовой, а в 1948 г. Г.М. Геймберг и Д.В. Кисиной удалось получить преципитирующие сыворотки путем иммунизации кроликов либо конденсатом питательной среды, на которой выращивался гриб Fusarium роае, либо растертой пленкой этого микроорганизма. Полученные сыворотки обладали преципитирующими и гемолизирующими свойствами. Титр их был, однако, низкий.
Позднее Г.И. Ежов получил более активные сыворотки. В ухо кролика он в поди л антиген, приготовленный из чистой культуры гриба Fusarium роае. Культура гриба выращивалась на безбелковой питательной среде. Aнтиген вводился пять раз с интервалом один — четыре дня. Сыворотка получалась на девятый день после последней инъекции антигена.
Эту сыворотку испытывали постановкой реакции преципитации по общепринятой методике. Антиген приготовляли как из токсичных, так и нетоксичных культур грибов рода Fusarium. Учеты реакции производили в течение одних суток, начиная с 5 минут после постановки пробы. Результаты оценивали по четырехбалльной системе с учетом интенсивности проявления преципитационного кольца.
Было установлено, что в течение первых 3 минут преципитационное кольцо образуется только с антигеном, к которому получена сыворотка. С антигенами других видов гриба Fusarium реакция наступала через 15—30 минут.
Кроме того, при реакции сыворотки с гомологичным антигеном преципитатное кольцо было хорошо заметно при разведении антигена 1:2500, а с антигенами из других культур оно появлялось лишь в разведениях, не превышающих 1:5000.
Полученные результаты дают основание предполагать, что реакция преципитации может быть положена в основу методики распознавания токсического зерна.
Для диагностики токсического зерна были предложены и некоторые химические пробы. Так, О.С. Манойлова для определения токсичности перезимовавших злаков рекомендовала к подкисленному экстракту зерна добавлять деципормальный раствор KMnO и метиленовую синь. По мнению автора, указанные реактивы характерно меняют свою окраску в присутствии токсического зерна.
Н.И. Козин и О.А. Ершова разработали метод обнаружения токсических веществ в жировой фракции перезимовавшего зерна по изменению цвета осадка солянокислого хлористого олова.
Л.Е. Олифсон указывает, что в присутствии токсического зерна образуется бурое кольцо при наслоении этилового эфира на омыленный двунормальным раствором щелочи экстракт жира из зерна.
Все эти химические пробы пока не получили должной апробации.