Определение степени зараженности пшеничного зерна и муки бактериями группы картофельной палочки

11.07.2015

Для определения степени зараженности пшеницы или пшеничной муки бактериями группы картофельной палочки, вызывающей «тягучую», или «картофельную» болезнь хлеба, предложено несколько способов. Каждый из них не лишен известных дефектов, но позволяет тем не менее выявить муку, хлеб из которой при его хранении в неблагоприятных условиях, может подвергнуться порче.
Повышенное число бактерий группы картофельной палочки в зерне п муке может быть установлено посевом исследуемого материала на питательную бактериологическую среду, пробными выпечками, показателями, связанными с биохимической деятельностью возбудителей заболевания хлеба и т. д. Некоторые из наиболее часто используемых методов описываются нами ниже. В зависимости от имеющегося оборудования можно остановиться на одном из них, или даже лучше работать двумя какими-либо методами, сопоставляя их показания, как взаимно контролирующие друг друга.
Метод посева на питательные среды. Как возможные возбудители тягучей болезни хлеба опасны лишь споры бактерий группы картофельной палочки, так как вегетативные клетки этих бактерий погибают при выпечке хлеба. Поэтому при исследовании муки, потенциально склонной к заболеванию, важно выяснить, имеются ли в ней споры интересующих нас бактерий.
Для проведения анализа 5 г зерна или муки помещают в небольшую колбу, содержащую 50 мл стерильной воды (разведение 1/10). Навеску исследуемого продукта взбалтывают в воде в течение 5 минут.
В том случае, если нужно определить общее число спор в зерне или муке, полученную суспензию подвергают пастеризации при температуре 75° в течение 10 минут. Началом пастеризации считается момент достижения пастеризуемой жидкостью температуры 75°. При такой обработке вегетативные клетки бактерий погибают, а споры остаются в жизнедеятельном состоянии; если же исследователя интересует вопрос о числе спор, остающихся в хлебе, то суспензию следует нагревать 10 минут при температуре 95°, так как исследования В.А. Мирзоевой показали, что при выпечке хлеба сохраняется примерно столько же спор картофельной палочки, сколько и после нагрева суспензии при 95° в течение 10 минут.
Прогретую при том или ином режиме суспензию разводят затем в пробирке со стерильной водой (при помощи стерильной пипетки) еще в 10 раз. Таким образом получают два разведения — в 10 и 100 раз. Из них делают глубинный или поверхностный посев в чашки Петри. В качестве питательной среды может быть использован мясо-пептонный агар (МПА). Лучше однако брать среду, рекомендованную Е.Н. Мишустиным. Она состоит из 50%-ного MIIA и 50%-ного сусло-агара. Среда должна иметь pH 7,0—7,2. На среде Мишустина очень легко дифференцируется видовой состав бацилл по внешнему виду их колоний.
Посевы выращивают при 25—30° в течение двух трех дней, после чего производят учет выросших колоний. Зная примененное для посева разведение и число выросших колоний, легко вычислить, сколько бактериальных спор приходилось на 1 г зерна или муки.
Кроме подсчета общего числа бактерий, необходимо отдельно учесть в посеве количество бактерий группы картофельной палочки. Это можно сделать после определении, по поверхностно выросшим колониям процента форм, относящихся к группе Вас. mesentericus — Вас. subtilis, что нетрудно выполнить (руководясь структурными особенностями бактериальных колоний и морфологическими свойствами клеток бактерий рассматриваемой группы, которые известны микробиологам).
Возникает вопрос, как оценивать полученные результаты. Накопленный материал показывает, что при пастеризации при 75° в течение 10 минут:

Определение степени зараженности пшеничного зерна и муки бактериями группы картофельной палочки

Обычно бактерии группы картофельной палочки составляют 25—60% от общего числа бацилл в посеве.
Метод пробных выпечек. Для определения степени зараженности муки спорами картофельной палочки в практике очень часто пользуются методом пробных выпечек.
Приготовленные из испытуемой муки небольшие хлебцы помещают в термостат при температуре 37°, Спустя одни, двое и трое суток из термостата вынимают и разламывают по одному хлебцу. Если хлеб был выпечен из муки, зараженной бактериями группы картофельной палочки, мякиш хлеба будет ослизненным, а на разломе будут видны тянущиеся нити. При возникновении порока хлеб, как правило, приобретает и неприятный запах.
Если порча хлеба отмечается через одни сутки содержания в термостате, то мука считается сильно зараженной спорами бактерий группы картофельной палочки. Наступление дефекта через двое суток говорит о средней степени инфекции и при порче хлеба через трое суток или отсутствии порчи муку считают слабозараженной бациллами картофельной группы.
Метод пробных выпечек может давать достоверные результаты лишь при стандартизации всех этапов работы. Следует строго регламентировать процесс тестоведения и выпечки хлебцев, размер последних не должен изменяться и т. д. Нередко этому в практике не придается большого значения, а между тем, изменяя условия приготовления опытных хлебцев и выдерживания их в термостате, можно резко изменить срок наступления тягучей болезни.
В некоторых руководствах указываются разные режимы выдерживания хлебцев в термостате, не учитывается влажность опытных хлебцев, кислотность их теста и т. д., в то время как все это имеет большое значение для получаемых результатов. При использовании метода пробных выпечек особое внимание следует уделять трем моментам: температуре хранения хлебцев, влажности мякиша и его кислотности.
Бактерии группы картофельной палочки имеют относительно высокие температурные оптимум и максимум. Энергичнее всего они размножаются при температуре 37— 44°. Поэтому биохимическая активность этих бактерий в опытных хлебцах проявляется наиболее быстро в условиях хранения их при температуре, близкой к оптимуму развития Вас. mesentericus. Некоторые исследователи предлагают выдерживать опытный хлеб при температуре 30—33°, В этих условиях порок проявляется значительно позже, и стираются отличия между образцами, имеющими разную степень заражения. Мы рекомендуем хлебцы выдерживать при температуре около 37°.
Опыты, проведенные с хлебом, имевшим одинаковую степень зараженности бактериями группы картофельной палочки, но различную влажность мякиша, показали, что чем меньше влаги в хлебе, тем слабее проявляются признаки тягучей болезни. Это вполне понятно, так как бактерии при прочих равных условиях энергичнее размножаются в более влажной среде. В пробных хлебцах желательно иметь влажность 44—45%.
Установлено также, что удлинение срока выпечки хлеба заметно ослабляет проявление болезни. Это отчасти связано с уменьшением влажности хлеба при более длительном его прогреве, а отчасти с большей гибелью в последнем случае бактериальных спор.
Огромное значение в проявлении тягучей болезни хлеба имеет его кислотность. При высокой кислотности (около 5°) хлеб остается совершенно неповрежденным, даже если все другие условия благоприятствуют развитию бактерий картофельной группы, а в хлебе имеется большое количество их спор. Поэтому в практике, во избежание порчи хлеба, выпекаемого из сильно зараженной картофельной палочкой муки, стараются возможно больше повысить кислотность теста. При проведении пробных выпечек титруемая кислотность хлеба должна равняться 3,6—4,3°.
Все отмеченные нами моменты показывают значение стандартизации условий при проведении опытных выпечек.
Н.И. Проскуряков и М.И. Ратнер предлагают при исследовании порчи хлеба картофельной палочкой не ограничиваться его органолептической оценкой, а делать на мякише йодную и биуретовую реакции. Эти реакции позволяют установить признаки порчи раньше, чем это удается сделать при исследовании внешнего вида хлеба и его запаха.
Метод заражения опытных образцов хлеба. В некоторых случаях для определения степени зараженности муки спорами бактерий группы картофельной палочки используют предложенный А.Ф. Войткевичем метод заражения здорового хлеба исследуемым материалом опытных образцов. В принципе этот метод может быть применен и для анализа зерна.
Исследование проводится следующим образом. Из навески испытуемой муки готовят серию разведений в стерильной воде. Рекомендуется брать разведения 1/10; 1/25; 1/50; 1/100; их лучше всего готовить в небольших колбочках, содержащих 50 мл воды. После тщательного взбалтывания суспензию муки пастеризуют при температуре 75° в течение 10 минут для уничтожения неспороносных бактерий. Однако исходя из наблюдений В.А. Мирзоевой можно рекомендовать параллельно ставить опыт с суспензией, прогретой в течение 10 минут при 95°. В таком случае первый вариант опыта покажет степень зараженности муки бациллами, а второй — потенциальную устойчивость к заболеванию хлеба, выпеченного из этой же муки.
После пастеризации из каждой колбочки стерильным шприцем (или пипеткой) отбирают 10 мл суспензии и вводят внутрь небольшой булочки, специально выпеченной из доброкачественной муки, слабо обсемененной спорами бактерий группы картофельной палочки. Можно использовать один шприц (или пипетку), если работу начать с больших разведений, переходя затем к более концентрированным болтушкам.
Опытные булочки помещают на 40 часов в термостат при температуре 37°, затем вынимают, разрезают и в них устанавливается наличие или отсутствие порчи мякиша. Мука, сильно обсемененная спорами группы картофельной палочки, дает резко выраженный порок хлеба при заражении его суспензиями всех разведений. При малом содержании в муке бактериальных спор заметный порок обнаруживается лишь в хлебцах, инфицированных концентрированными суспензиями.
Описанный анализ является качественным, но при использовании для изготовления опытных хлебцев чистой в отношений бактериальных спор муки может дать неплохие результаты.
К методу А.Ф. Войткевича близок метод Ваткинса; этот автор рекомендует суспензией муки заражать не хлебцы, а стерильные кусочки белого хлеба.
Биохимические пробы, которые рекомендованы рядом исследователей, основаны на некоторых биохимических свойствах бактерий картофельной группы. Мы приводим здесь лишь пробы, разработанные В.А. Мирзоевой и М.И, Ратнер.
Бактерии группы картофельной палочки довольно активно разлагают Н2О2, т. е. обладают ферментом каталазой. Чем сильнее мука будет заражена картофельной палочкой, тем большие показатели даст каталазная проба.
Определение степени зараженности пшеничного зерна и муки бактериями группы картофельной палочки

Работа по методу В.А. Мирзоевой проводится следующим путем. Навеска муки (4 г) вносится в колбочку, содержащую 100 мл стерильной воды. Содержимое колбы тщательно взбалтывается и 10 минут пастеризуется при температуре 95°. Этим уничтожаются неспороносные бактерии и ката л аза, которая имеется в муке. После некоторого охлаждения (примерно до 37°) колба с ее содержимым ставится на 12 часов в термостат с температурой 37° для того, чтобы из спор могли развиваться вегетативные формы бактерий, имеющие каталазу. Понятно, что число развившихся палочек будет пропорционально количеству спор, содержавшихся в муке.
После выдерживания в термостате 15 мл болтушки переносится в прибор («каталазник»), представляющий собой градуированную пробирку емкостью 20 мл, закрытую каучуковой пробкой. Через пробку пропущена стеклянная трубочка с оттянутым концом (рис. 58). Если такой прибор заполнить жидкостью и перевернуть, жидкость не должна вытекать без дополнительного давления изнутри.
К 15 мл мучной болтушки добавляется перекиси водорода и пробирка таким образом целиком заполняется. Затем она быстро закрывается каучуковой пробкой, несколько раз перевертывается для перемешивания ее содержимого п укрепляется в штативе пробкой книзу. Под оттянутый конец стеклянной трубочки подставляется стаканчик для сбора вытекающей из пробирки воды, которая будет вытесняться из каталазника под давлением кислорода выделяющегося из перекиси водорода. Каталазник выдерживается 24 часа в термостате при температуре 37°, после чего по имеющейся на пробирке градуировке отсчитывается объем выделенного газа.
Проверка довольно большого количества образцов муки с разной степенью зараженности картофельной палочкой позволяет установить известное соотношение между количеством выделенного кислорода и обсемененностью исходного образца муки.
Соотношение между зараженностью муки картофельной палочкой и количеством выделенного кислорода следующее:
Определение степени зараженности пшеничного зерна и муки бактериями группы картофельной палочки

Проба, рекомендованная М.И. Ратнер для установления степени зараженности муки картофельной палочкой, проводится следующим образом. 5 г муки и 0,2 г мела помещают в Эрленмейеровскую колбу, содержащую 25 мл стерильной водопроводной воды, подогретой до 90—95°. Мел берется для нейтрализации кислых продуктов, которые могут образоваться при последующем брожении. Колбу погружают в кипящую баню или аппарат Коха (100°), где нагревание продолжается 30 минут, после чего колбу вынимают из бани или кипятильника и ставят в термостат (37°) на 12—14 часов. Затем в колбу добавляют еще 25 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 30° и все содержимое колбы сильно взбалтывают, так как в ней не должно остаться сгустков. После этого колбу оставляют при комнатной температуре на 1 час, а затем все ее содержимое переносят в центрифужную пробирку, где отделяют твердую часть от жидкой путем центрифугирования. Жидкую часть сливают, оставляя в пробирке несколько миллиграммов воды (7—8). Этот остаток взбалтывают и переносят в две химические пробирки, наливая в одну из них около 5 мл суспензии, а в другую — около 1 мл. В ту пробирку, где имеется 5 мл суспензии, добавляют 0,2 мл 5—7 %-ного спиртового раствора иода, а в другую, содержащую 1 мл, вливают 0,5 мл 33%-ной щелочи. Содержимое последней пробирки перемешивают и к нему осторожно прибавляют несколько капель почти бесцветного раствора CuSO4.
Через 20 минут производят наблюдение за цветом растворов в опытных пробирках. Если в первой пробирке наблюдается синее окрашивание, т. е. крахмал не разложился, то мука может считаться нормальной. Если же отмечается фиолетовый, красноватый тон или жидкость обесцвечивается совершенно, то это свидетельствует о распаде крахмала и о более или менее сильной зараженности муки зародышами картофельной палочки.
От второго реактива (CuSО4 в щелочной среде) в сильно инфицированной муке появляется кольцо фиолетового или красноватого тона, что говорит о разложении белка и образовании пептонов.
Описанную выше пробу, как и пробу, рекомендованную В.А. Мирзоевой, целесообразно сочетать с посевом суспензии исследуемого материала на твердую питательную среду.