Анализ микрофлоры зерна и муки методом посева на твердые питательные среды

Микробиологический анализ весьма различных объектов производится почти одинаково. Методика этого анализа описана в руководствах по микробиологии и здесь мы ее касаться не будем. Однако работа с зерном и мукой имеет некоторую специфику.
Наши методические указания будут начаты с изложения сведений по определению общего характера микрофлоры интересующих нас продуктов.
Учет общего количества и видового состава бактерий, грибов и актиномицетов может быть произведен посевом смыва с зерна или суспензии муки на твердые питательные среды. Сапрофитные бактерии, которые интересуют нас больше всего, хорошо развиваются на мясо-пептонном агаре (МПА), На этой же среде растет большинство актиномицетов. Мясо-пептонный агар является весьма благоприятной средой для большинства неспороносных и спороносных бактерий. Значительная часть последних не может расти на средах, лишенных органического азота.
Для учета видового разнообразия спороносных бактерий мы рекомендуем питательную среду, состоящую из 50%-ного MПA и 50%-ного сусло-агара (pH = 7,0). Нa такой питательной среде разные виды бацилл дают весьма характерные колонии, что облегчает их дифференцировку.
Для учета неспороносных бактерий и актиномицетов весьма подходящей средой является крахмало-аммиачный агар, который можно использовать при анализе микрофлоры зерна и муки одновременно с МПА.
Для учета микроскопических грибов обычно используют подкисленный сусло-агар или агаризованную сахарозо-нитратиую среду Чапека. Грибы хорошо выносят кислую реакцию среды, в то время как рост большинства бактерий и актиномицетов при pH ниже 5,0 подавляется. Это делает кислые среды избирательными для грибных организмов. Некоторые грибы, например, мукоровые, хорошо растут лишь на средах с органическим источником азота. Другие же одинаково хорошо усваивают как минеральные, так и органические азотсодержащие вещества. Поэтому мукоровые грибы (наряду с другими) удается учесть лишь при посеве исследуемого материала на подкисленный сусловый агар, в то время как на агаризованной среде Чапека, содержащей минеральный азот, они не растут. Следовательно, для более полного учета видового разнообразия грибов, населяющих зерно и муку, лучше пользоваться параллельно сусло-агаром и агаризованной средой Чапека.
Так как зерно и мука весьма богаты микроорганизмами, для посева необходимо использовать относительно разбавленные смывы или суспензии (в случае анализа муки). Поэтому из первоначально приготовленных болтушек делают несколько последующих десятикратных разбавлений.
Приготовление болтушки производят следующим образом. Из средней пробы берут навеску в 5 г зерна или муки, всыпают в колбу, содержащую 50 мл стерильной воды. Перед стерилизацией в воду целесообразно внести некоторое количество стеклянных бус. При встряхивании в воде взятой навески бусы облегчают отделение и диспергирование микроорганизмов. Встряхивание продолжается 5 минут. Если в лаборатории делаются массовые анализы, следует для встряхивания пробирок иметь специальный аппарат.
Только что отмеченным способом готовится разведение числа микробов, имеющихся в исходной пробе, в 10 раз.
После того, как приготовлено разведение 1/10, делают несколько последующих десятикратных разведений микроорганизмов.
При отмеченных операциях диспергируются имевшиеся на испытуемом материале скопления бактерий, а мицелий грибов и актиномицетов может быть расчленен на несколько частей. При выращивании отдельных клеток (или групп их), а также обрывков мицелия на твердых питательных средах вырастают колонии, каждая из которых считается произошедшей из одного зародыша. Условность подобного допущения совершенно очевидна, и поэтому количественны о показатели, получаемые при микробиологическом анализе, должны расцениваться как несколько условные, но все же дающие представление об относительной плотности микробного населения зерна или муки.
Для учета бактерий и актиномицетов из приготовленных разведений незамедлительно производят посевы в чашки Петри на МПА и крахмало-аммиачный агар. Допустимо использование глубинного или поверхностного посева. Глубинный посев более прост и требует меньшей затраты времени, чем поверхностный. Недостатком глубинного посева является затрудненная последующая дифференцировка видовой принадлежности развивавшихся бактериальных колоний, которая обычно делается на основе анализа внешнего вида и структурных особенностей выросших колоний, сопровождаемого микроскопическим исследованием бактерий.
При глубинном посеве лишь часть высеянных бактерий образует колонии на поверхности питательной среды, большинство же зародышей прорастает в глубине агара. В последнем случае вырастают весьма трудно дифференцируемые глубинные колонии.
При глубинном посеве, из ряда разведений (обычно 1/100, 1/1000 и 1/10000) стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, которую переносят на дно стерильной чашки Петри. Анализируемый материал заливают затем расплавленной, но несколько охлажденной (45° С) агаризованной средой, Из каждого разведения посев производят параллельно в 2—3 чашки.
При поверхностном посеве расплавленный MПA (или другую агаризованную среду) предварительно разливают на дно чашек Петри и после того как среда застынет, ее поверхность подсушивают в сушильном шкафу.
Посев производят на поверхность подсушенной среды.
Для этого из разведений в 1/10, 1/100 и 1/1000 стерильной пипеткой берут суспензию в количестве 0,1 мл и наносят ее на поверхность застывшей среды.
Когда посев сделан, суспензию распределяют но поверхности среды стерильным стеклянным шпателем, a затем ровно распределенную жидкость этим же шпателем втирают в среду. Из каждого разведения засевают 2—3 чашки Петри.
Для посева из каждого разведения следует использовать особый шпатель.
Чашки Петри с посевами, произведенными глубинным или поверхностным методом, в перевернутом виде (крышкой вниз) помещают в термостат, установленный на 25—30°; чашки устанавливают в таком положении для того, чтобы испаряющаяся вода, конденсируясь на крышке, не канала на поверхность среды, что может вызвать слияние колоний.
Через 48 часов после посева подсчитывают выросшие колонии. Если выращивание производилось при более низкой температуре, то посевы выдерживают в термостате больший срок.
Для подсчета бактерий необходимо брать такие разведения, при которых в чашках вырастает от 50 до 150 колоний. При большем количестве колоний подсчет становится затруднительным и неточным. Однако, если выросло больше 150 колоний и нет посевов с других разведений, то допускается подсчет колоний на определенной части чашки, с помощью лупы. В последующем делается пересчет на площадь всей чашки. Чашки с малым количеством колоний не используются ввиду того, что случайные загрязнения их посторонней микрофлорой могут дать существенную ошибку при последующих пересчетах.
После подсчета числа колонии, выросших на питательной среде, можно вычислить количество бактерий, приходящихся на 1 г зерна или муки. При пересчете допускается, что каждая колония выросла из одного микроорганизма. Известная условность этого допущения нами уже указывалась выше.
Подсчитанное на чашке Петри число колоний умножают на степень разведения и получают показатель обсемененности продукта бактериями пли другими группами микроорганизмов.
При необходимости дифференцировать групповой и отчасти видовой состав бактерий, чашки Петри с развившимися на них колониями оставляют при комнатной температуре еще иа несколько дней. При этом происходит лучшая обрисовка внешнего вида колоний, что облегчает распознавание отдельных видов микроорганизмов. Из числа колоний, развившихся на МПА или крахмалоаммиачном агаре можно выделить следующий группы (или виды):
1. Желтоокрашенные плоские колонии (принадлежат Pseudomonas herbicola aureum),
2. Бесцветные плоские, иризирующие или флюоресцирующие колонии (в основном относятся к роду Pseudomonas и преимущественно к виду Ps. fluorescens).
3. Бесцветные, матовые плоские колонии — образуются разными представителями рода Bacterium.
4. Молочнобелые желтоватые или других тональностей куполообразные колонии — как правило, представители разных видов микобактерий.
5. Куполообразные колонии (очень часто принадлежат микококкам). Микококки могут давать бесцветные молочнобелые или желтоватые колонии.
6. Крупные колонии с различной структурой обычно принадлежат различным видам спорообразующих бактерий.
7. Плотные колонии, нередко покрытые пушистым налетом (как правило являются актиномицетами). Они обычно имеют белый или сероватый тон, но иногда окрашены в разные топа солнечного спектра.
8. Относительно крупные, состоящие из грубого мицелия колонии (принадлежат различным грибам). В сильно загрязненном микроорганизмами зерне на МПА и крахмало-аммиачном агаре возможно появление значительного количества колоний плесеней.
При дифференцировании микроорганизмов на названные группы необходимо широко использовать микроскопию. Макроскопически вид колоний разных групп микробов может быть почти тождественным и микроскопическая картина дает существенные коррективы.
Так, например, бактерии рода Pseudomonas (пигментированные и непигментированные) представляют собой мелкие подвижные палочки со жгутиком или группой жгутиков па одном конце клетки. Неспороносные палочки, имеющие перетрихиальные жгутики или не обладающие подвижностью, должны быть отнесены к роду Bacterium.
Микобактерии имеют весьма специфическую морфологию, описанную нами в соответствующем разделе. Их палочки нередко изогнуты и часто имеют разветвления, а кокковидным формам микобактерий свойственна угловатость формы и разные размеры клеток. У типичных кокков клетки обычно имеют одинаковую величину и строго округлую форму. Спорообразующие бактерии распознаются по наличию спор, а в неопороносном состоянии — по относительно большим размерам клетки. Колонии некоторых видов спорообразующих бактерий опытный микробиолог без особого труда различает по внешнему виду. Актиномицетам свойственен тонкий мицелий. Мицелий грибов легко отличается по его значительной толщине.
Пользуясь только что отмеченными признаками, можно произвести лишь ориентировочную групповую дифференцировку микроорганизмов, выросших на той или иной питательной среде. Для точного определения интересующего исследователя вида микроба его следует перенести в пробирку, очистить от возможных примесей и затем точно изучить морфологические, культуральные п физиологические признаки. Лишь это дает возможность приблизиться к установлению вида. Детальное изучение чистых культур микроорганизмов производится, однако, лишь в специальных случаях, но не при массовых анализах зерна или муки.
Возникает вопрос, как же расценивать данные бактериологического анализа зерна или муки? Мы считаем необходимым дать здесь некоторые разъяснения по этому поводу.
Общее число бактерий в зерне и муке может весьма сильно варьировать, но обычно не превышает 2000—3000 тыс. на 1 г продукта. На общей обсемененности зерна и муки сказывается ряд факторов — условия погоды, при которых выращивался посев, характер помола, длительность хранения продукта и т. д. Таким образом, общая численность микробов не может служить критерием качества продукта. Лишь в случае чрезмерного увеличения числа бактерий можно думать о возможной порче продукта, а в случае резкого уменьшения — о большой длительности его хранения.
Значительно более показательным для характеристики качеств зерна или муки является количество колоний Pseudomonas herbicola. Большое количество их служит признаком хорошего качества продукта. В доброкачественном зернe и муке содержание Ps. herbicola обычно не ниже 40%. Чаще же оно значительно выше.
В зерне и продуктах его переработки, хранящихся в нормальных условиях, практически отсутствуют кокки (микрококки). Их число становится сколь-либо ощутимым лишь при увлажнении продукта. Размножение кокков приводит одновременно к снижению абсолютного и относительного числа Pseudomonas herbicola.
Число спороносных бактерий в зерне и муке обычно не превышает 1000 на 1 г, что для свежих продуктов составляет обычно не более 1 % от общего числа бактерий. При хранении продуктов вымирают главным образом неспороносные бактерии и поэтому при неизменной абсолютной численности относительное количество бацилл возрастает.
В случае самосогревания зерна бациллярная микрофлора в нем сильно увеличивается и нередко доходит до нескольких тысяч (а иногда десятков тысяч) на 1 г. Особенно сильно увеличивается при этом число бактерий из группы Вас. mesentericus — Вас. subtilis. Pseudomonas herbicola в греющемся зерне исчезают.
Актипомицеты встречаются в зерне и муке в небольших количествах и показателем качества этих продуктов не являются.
Учет грибной микрофлоры (микофлоры) производится теми же методами, что и учет бактерий. Однако для посевов (поверхностных и глубинных) используются другие-среды — подкисленный сусло-агар или агаризованная сахарозонитратная среда Чапека. Можно также использовать и иные субстраты, рекомендованные для проращивания микроскопических грибов.
Обычно нормальное зерно, а также мука бедны грибной микрофлорой. Поэтому для глубинного посева рекомендуется брать по 1 мл из разведений 1/10 и 1/100. Для поверхностного посева следует брать из тех же разведений по 0,1 мл.
Грибы проращивают три-четыре дня при температуре около 25°, а затем подсчитывают число выросших колоний. Желательно также произвести дифференцировку грибов по их принадлежности к родам Penicillium, Aspergillus, Mucor, Alternaria и т. д. Полученные данные пересчитывают на 1 г продукта.
В доброкачественном зерне число грибов, учитываемых методом посева колеблется в пределах от 0,5 до 3 тыс. на 1 г. Примерно в той же степени микроскопическими грибами осеменена и мука. Сколько-нибудь заметное увеличение численности грибов в зерне и муке говорит о начавшейся их порче в результате местного или общего повышения влажности. Как уже отмечалось ранее, в зерне обычно преобладают грибы из рода Penicillium. Существенное возрастание численности представителей рода Aspergillus связано с повышением температуры зерна или муки при хранении.
В ряде случаев приходится устанавливать в зерне и муке численность бактериальных спор. При обычном посеве на питательной среде прорастают как вегетативные клетки, так и споры бацилл. Однако последние обладают значительной теплоустойчивостью и подчас приходится выяснять их численность в продукте. Особенно это важно при диагностике склонности муки к «тягучей» или «картофельной» болезни. Поэтому данный анализ описан в разделе, посвященном определению степени зараженности зерна и муки бактериями групп картофельной палочки.
В некоторых случаях, особенно при изучении самосогревания зерна и муки, приходится учитывать термофильные микроорганизмы. При высокой температуре (до 80°) способны развиваться лишь некоторые бактерии и актиномицеты. Наиболее теплолюбивые грибы прекращают развиваться при температуре 55—60°. Таким образом при исследовании термофилов основное внимание приходится уделять бактериям и актиномицетам.
Учет термофильных микроорганизмов (бактерий и актиномицетов) может производиться на МПА или агаризованной сахарозо-нитратной среде Чапека. Посев глубинным или поверхностным способом делается из серии разведений, и чашки Петри ставятся во влажной камере в термостат с температурой 60°. Развившиеся колонии учитывают через одни сутки, так как термофилы растут очень быстро.
Сопоставление данных по бактериальной и грибной микрофлоре зерна позволяет сделать вполне обоснованное заключение о ряде его особенностей. Совершенно естественно, что окончательное заключение о качество зерна должно базироваться на совокупности данных биохимического и микробиологического его исследований.