Техника изготовления препаратов, необходимых для определения молей и огневок

27.05.2015

Точное определение вида многих близких между собой молей и огневок требует изготовления препаратов для детального рассматривания не только под препаровальной лупой, но и под бинокуляром и микроскопом. Чаще всего приходится делать макропрепараты жилкования крыльев, хетотаксии ног. Однако нередки случаи, когда определение становится возможным только после изготовления микропрепаратов. К этому способу особенно прибегают в том случае, когда имеют дело с испорченным до неузнаваемости, поломанным материалом или с остатками насекомых, особенно при всякого рода экспертизах. В этих случаях часто даже под бинокуляром не удается рассмотреть отдельные мелкие признаки, такие как соотношение длины члеников в губных и челюстных щупиках, детали строения полового аппарата у бабочек, расположение и число крючков на подошвах брюшных ног или хетотаксию гусениц и т. д. Здесь-то и приходят на выручку микропрепараты, которые изготовляются из отдельных частей тела взрослых насекомых (ротового аппарата, усиков, гениталий) и гусениц.
Ниже мы познакомимся с техникой изготовления макро- и микропрепаратов.
Структуру жилок лучше рассматривать на нижней поверхности крыла, где жилки более отчетливые. У крупных бабочек, например огневок, для лучшего выявления жилок крыло слегка смачивается с помощью кисточки ксилолом, толуолом, бензолом или бензином, спиртом. Удобно рассматривать жилкование крыльев крупных бабочек, отделив их от тела и поместив на предметное стекло; затем на крыло накладывают покровное стеклышко и капают одной из вышеуказанных жидкостей на предметное стекло; жидкость подтекает под покровное стекло и смачивает крыло.
У мелких бабочек для изучения жилкования необходимо с крыла удалить чешуйки. Для этой цели крыло у корня отсекается или обламывается я укладывается на слегка влажное стекло, к которому оно прилипает; затем чешуйки удаляются сначала с одной стороны, затем с другой тонкой влажной кисточкой из верблюжьего или колонкового волоса. У очень мелких молей чешуйки с крыла лучше счищать головкой тонкой энтомологической булавки, при этом чешуйки удаляются небольшими участками.
Для рассматривания жилкования может быть использована 10—20-кратная ручная или препаровальная (штативная) лупа.
Изготовление микропрепаратов требует известных навыков и производится различными способами.
Для того чтобы рассмотреть строение ротового аппарата бабочек, гениталий самца и самки, их необходимо соответствующим образом обработать. Для этого с помощью тонкой препаровальной иглы отделяют голову и все брюшко у его основания и помещают в пробирку, бюксик, маленький стаканчик или фарфоровый тигелек, куда затем наливают 2—3 см3 10%-го раствора едкой щелочи (КОН или NaOH), и на слабом огне медленно кипятят до полного их просветления; после этого сильно склеротизованный копулятивный аппарат (обычно темно-коричневого цвета) становится ясно заметным сквозь прозрачные стенки брюшка. Голову необходимо варить до тех пор, пока слегка не посветлеют глаза, что происходит обычно через 2—3 мин. после начала обработки, тогда как гениталии приходится кипятить до 10 мин. и более. Если варка производится в пробирке на спиртовке, то во избежание выплескивания или разбрызгивания, которое происходит при бурном кипении, необходимо все время взбалтывать жидкость, слегка потряхивая пробирку. После того как варка головы или гениталий окончилась, их вынимают препаровальной иглой и промывают водой не менее 2 раз; рекомендуется также для лучшего удаления щелочи прокипятить их в 2—3 см3 воды. После промывания препараты помещают на предметное стекло в каплю смеси: 1 часть глицерина и 2 части спирта. Лучше для этой цели использовать толстые предметные стекла с небольшими луночками в них. После того как диффузия жидкости окончится (обычно она длится 1—2 мин.) и препарат будет лежать спокойно на стекле под жидкостью, предметное стекло осторожно переносят под бинокуляр, где с помощью препаровальных игл расправляют в нужном положении. Голову рекомендуют класть таким образом, чтобы усы были обращены вверх и в стороны, лоб расположен в сторону исследователя, губные и челюстные щупики обращены вниз и в стороны, а между ними спускался хоботок; кроме того, голову необходимо ориентировать таким образом, чтобы хорошо были видны ямки в основании первого членика усиков и начало темени.
При рассматривании копулятивного аппарата брюшко ориентируют таким образом, чтобы первые его членики были внизу, а хвостовые вместе с гениталиями вверху; кроме того, в большинстве случаев брюшко самца поворачивают на бок, чтобы тергиты сегментов брюшка были бы слева, а стерниты справа; при таком положении в гениталиях ункус будет находиться слева, а вальвы и саккус справа, т. е. гениталии будут рассматриваться сбоку. Брюшко самки переворачивают стернитами к наблюдателю, т. е. его кладут на спину. Кроме того, для лучшего рассмотрения деталей копулятивного аппарата необходимо вытянуть гениталии из брюшка. Для этой цели требуется одной иглой слегка придерживать брюшко за первый членик, тогда как другой, осторожно зацепив за ункус в мужских или за анальные сосочки в женских гениталиях, медленно вытянуть гениталии из брюшка; при вытягивании гениталий разрыв перепонок, связывающих их с брюшком, нежелателен, так как при этом гениталии всплывают на поверхность, скользят по жидкости, все это затрудняет работу с ними, а их небольшие размеры увеличивают возможность потери при длительном храпении.
Для того чтобы препарат сохранял заданное ему положение, можно в каплю погрузить несколько волоконец ваты и положить на них препарат; кроме того, при удержании головы помогает также высовывание усиков из капли на стекло. При сохранении ориентации гениталий можно высовывать несколько первых члеников брюшка из капли на стекло, таким путем удается довольно длительное время сохранять препараты в неподвижности и в заданном положении. Этот способ находит себе применение при одновременном сравнении двух-трех гениталий близких видов, когда все гениталии кладутся рядом и одинаково ориентируются (при этом обязательно необходимо записать, какие гениталии относятся к каким экземплярам насекомых!).
В гениталиях самца, после того как они будут выдвинуты и надлежащим образом положены, т. е. на бок, необходимо иглой отогнуть верхнюю вальву, а пенис выдвинуть так, чтобы можно было свободно рассмотреть его вершинную перепончатую часть.
Исследование препаратов головы и копулятивного аппарата проводится под бинокуляром с увеличением в 40—60 раз, а отдельных мелких -структур под микроскопом при стократном увеличении.
Для изучения внешнего строения тела гусеницы, строения грудных и брюшных ног, дыхалец и крючков в венце брюшных ног и т. д. гусениц необходимо соответствующим образом обработать или фиксировать.
В практике лабораторного анализа приходится иметь дело с гусеницами разной сохранности и доставленными в различном виде — от высохших мертвых и заспиртованных до живых гусениц. Если имеются живые гусеницы, то их необходимо фиксировать кипящей водой, причем если гусеницы небольшие, до 3 мм, то для этого достаточно опустить гусениц в кипяток и оставить их там на короткий срок без кипячения. Крупные гусеницы следует выдержать 1—2 мин. в горячей воде, осторожно доводя их до кипения. Кипячение гусениц производят в химических пробирках. Пробирку держат в верхней части пламени спиртовки под углом примерно в 45° с помощью специальной деревянной держалки или держалки, сделанной из 2—3 раза согнутой вдоль полоски плотной бумаги, которой обхватывают верхнюю часть пробирки. При нагревании необходимо слегка встряхивать пробирку. После окончания кипячения содержимое пробирки выливают на большое часовое стекло или чашку Петри, пинцетом осторожно вынимают гусеницу и переносят на небольшое часовое стекло в воду.
Однако следует помнить, что фиксированная кипячением гусеница растягивается, поэтому точное измерение ее длины нужно делать до кипячения. Также до кипячения следует отметить положение головы по отношению к груди, так как втянутая голова после кипячения выдвигается из груди.
Если необходимо исследовать сухих или заспиртованных гусениц, то их сначала помещают в слабый раствор едкой щелочи (КОП или NaOH). В химическую пробирку наливают примерно 3—5 см3 воды, добавляют с помощью пипетки несколько капель 10%-го раствора щелочи и опускают туда гусеницу. Затем пробирку нагревают в течение 1—2 мин. над пламенем спиртовки, после чего горячий раствор вместе с гусеницей выливают в чашку Петри, пинцетом осторожно переносят гусеницу на небольшое часовое стекло в воду.
Чтобы покровы тела гусеницы во время дальнейшего нрепарования лучше смачивались водой и гусеница не плавала па поверхности, можно применить способ, указанный Е.И. Павловским. Этот способ состоит в Том, что гусеницу берут пинцетом и на 1—2 сек. погружают в 96%-й спирт, после чего ее переносят в физиологический раствор (раствор из 0.7—0.8 г химически чистой поваронной соли в 100 мл дистиллированной воды) и выдерживают в нем несколько секунд, пока не прекратятся диффузные токи. После этого гусеницу переносят на небольшое часовое стекло или в лунку предметного стекла, где также имеется небольшое количество физиологического раствора.
Для изучения хетотаксии гусениц, деталей строения ротового аппарата или других отдельных частей тела их необходимо перед изготовлением микропрепаратов специально обработать щелочью и отпрепарировать.
Препарирование производят под бинокуляром с помощью глазного скальпеля или куска лезвия безопасной бритвы, вставленного и закрепленного в толстую спичку или тонкий карандаш. Придерживая гусеницу тонким острым пинцетом, разрезают ее кожу вдоль всего тела по правому боку, начиная от анального конца брюшка к голове. После этого гусеницу снова помещают в пробирку, куда наливают 10—15%-й раствор едкого кали или натра и кипятят до тех пор, пока мягкие ткани не отделятся от кожи. Для этого достаточно кипятить от нескольких секунд до 1—2 мин., в зависимости от величины и зажиренности гусеницы. Варка в щелочи производится с большой осторожностью, чтобы не переварить гусеницу, так как на теле переваренных гусениц могут опасть все щетинки, что затруднит в дальнейшем определение, а кожа такой гусеницы делается настолько нежной, что рвется при первом прикосновении иглы. Вместо кипячения можно оставлять гусениц в щелочи на ночь. Очень хорошо действует щелочь при температуре 25—30° Q в термостате. После мацерации объект тщательно промывается водой. В некоторых случаях лучше не употреблять щелочи, а очищать шкурку от жирового тела иглами. Если материал, поступивший на определение, находился в 75%-м спирте с предварительным провариванием в воде, то гусеницы, хорошо промытые сильной струей из пипетки, после этого не требуют очистки; необходимо лишь удалить трахеи.
В некоторых случаях, в особенности при других способах фиксации, удаляют после промывки оставшиеся куски жирового тела с помощью игл и тонкого пинцета или лучше специально изготовленных из тонких энтомологических булавок маленьких крючков. Еще лучше пользоваться иглой с расплющенным в лопатку концом и загнутым в виде крючка. Чтобы приготовленная таким образом шкурка хорошо расправилась на предметном стекле, следует сделать скальпелем надрезы между особенно сморщивающимися сегментами.
Очень мелких гусениц, которых ножницами пренарировать нельзя, удается разрезать маленьким скальпелем. Положив гусеницу на спинную или брюшную сторону (лучше на восковую или парафиновую пластинку), разрезают ее вдоль тела посредине или ближе к правой стороне, надавливая скальпелем, придерживая и подправляя иглой или тонким пинцетом. Если это не удается, ее препарируют тонкими иглами, изготовленными из энтомологических минуций. При этом на одном экземпляре удается отпрепарировать лишь некоторые сегменты, а для изучения остальных приходится брать другой экземпляр.
Наряду с изготовлением препаратов из обработанных вышеописанным способом очищенных и развернутых шкурок гусениц практикуется исследование гусеницы без препарирования. Рассматривание хетотаксии на непрепарированных гусеницах имеет то преимущество, что при нем не искажается взаимное расположение щетинок, чего трудно избежать при изготовлении препаратов на разрезанных гусеницах, кроме того, не затрачивается время на изготовление микропренарата. Ho на целой гусенице часто нельзя рассмотреть всех щетинок, в особенности мелких, что без труда удается на препаратах.
Для подробного морфологического описания необходимо обязательное изготовление микропрепарата. Конечно, еще лучше комбинировать оба способа. Если отпрепарированные и распластанные на предметном стекле шкурки гусениц не заделываются окончательно в канадский бальзам, то после изучения и определения их можно хранить в маленьких пробирках в смеси из спирта и глицерина (2 части 96%-го спирта, 2 части воды и 1 часть глицерина).
Голову гусениц приходится выдерживать в щелочи дольше и вообще очистка головы требует терпения, так как ткани трудно извлекаются и нужно не повредить тентория. Можно рекомендовать промывку головы шприцем; иглу его вставляют в затылочное отверстие и струей воды вымывают все ткани, если они хорошо мацерированы щелочью. Очистку головы производят, не отделяя ее от шкурки тела; со шкуркой удобно придерживать голову при промывании. При отделении головы от шкурки нужно не повредить переднего участка переднегруди. Сильно пигментированные головы полезно обработать диафанолом для депигментации, что делает щетинки более заметными. Для этого препараты выдерживают долгое время в диафаноле, время от времени заменяя его свежим.
Чтобы удобнее было рассматривать голову сбоку, ее разрезают на три части; при этом лобную часть отделяют вместе с небольшими частями боковых полушарий так, чтобы щетинка осталась при ней.
Для исследования ротовых органов их расчленяют. Сначала отделяют от головной капсулы комплекс из нижних челюстей и нижней губы; это легко удается, если разорвать черепную капсулу с лобной стороны. Выделенный комплекс можно рассматривать целиком или, если необходимо, расчленять дальше, при этом выделяют нижнюю губу и исследуют подглоточник.
Верхняя губа и жвалы отделяются от головной капсулы без труда. В некоторых случаях при определении требуется рассмотреть прядильный сосочек, который при навыке может быть выделен иглой без расчленения головы. Техника приготовления и заделывания препаратов в данном случае ничем не отличается от обычной техники препарирования хитиновых частей насекомых.