Активизация α- и β-амилаз

29.10.2014

Co времени классических исследований Баха и Опарина ферментов покоящегося и прорастающего зерна пшеницы огромное внимание технологов и биохимиков привлекает вопрос об активности амилаз. Это обусловлено не только тем, что повышение способности проросшего зерна гидролизовать крахмал имеет непосредственное отношение к качеству муки, но и тем, что величина активности амилаз может служить индикатором технологических свойств зерна и муки, на основе которого можно своевременно принимать меры к регулированию этих свойств различными способами.
При соответствующих условиях влажности, температуры и доступа кислорода уже в первые сутки обнаруживается повышение активности комплекса амилаз, в частности α-амилазы. На рисунке 73 представлен ход изменения ее активности по мере прорастания твердой пшеницы, ржи и Тритикале. Наиболее быстрое увеличение активности α-амилазы отмечено у зерна ржи, а наименее быстрое — у твердой пшеницы, но является ли это общей закономерностью или только частным случаем, сказать трудно. Большое влияние на процесс активирования α-амилазы оказывает температура, при которой происходит прорастание. Наиболее быстрые темпы увеличения активности α-амилазы отмечены при температуре 20°С, а наименее быстрые — при 5°С. Однако и при низкой температуре ее активность достигает того же максимума, что и при оптимальных условиях прорастания. Это показывает, что в зависимости от внешних факторов активность α-амилазы может сильно колебаться и не всегда внешние признаки прорастания будут коррелировать со способностью зерна гидролизовать крахмал. Это затрудняет контроль за качеством проросшего зерна.

Исследования, проведенные в настоящее время, значительно разъяснили механизм активирования α-амилазы в прорастающих зерновках злаков. Особенно детально этот вопрос был изучен на примере ячменя, процесс проращивания которого является основой пивоваренного производства. Главную роль при этом играют гиббереллиновые кислоты. Свойства этого биостимулятора подробно изложены в соответствующих монографиях и обзорах. В отношении зерновки ячменя было показано, что при ее замачивании гиббереллиновые кислоты начинают поступать из зародыша через щиток и равномерно распределяться по дорзальной и вентральной частям зерна, стимулируя появление в них α-амилазы. He только эндосперм, но и алейроновый слон способен образовывать активную а-амилазу в ответ на поступление в. него гиббереллинов из зародыша. Решающая роль гиббереллинов в активировании α-амилазы доказана опытами. При погружении алейронового слоя, отделенного от других частей зерновки и в частности от зародыша, в раствор гиббереллииовой кислоты ГАз в нем начинает накапливаться α-амилаза, которая затем выделяется во внешнюю среду. Аналогичный процесс наблюдается также и в отделенном от зародыша эндосперме при инкубации его в растворе гиббереллииовой кислоты ГАз.
Добавление гиббереллиновой кислоты при замачивании целого зерна значительно ускоряет активирование α-амилазы пшеницы, ржи и Тритикале.
Образование активной α-амилазы под влиянием гиббереллииовой кислоты наблюдали также и на зерновке риса. В проведенных опытах нормально вызревшие зерновки разрезали в поперечном направлении на две части, одна из которых содержала зародыш. Эту часть инкубировали для проращивания обычным способом, а вторую, лишенную зародыша, инкубировали в гиббереллиновой кислоте.
Полученные экстракты изучали методом электрофореза в полиакриламидном геле, причем в обоих случаях обнаруживалось наличие четырех главных и 9—10 минорных изоэнзимов, почти идентичных друг другу. Следовательно, под воздействием гиббереллиновой кислоты происходило формирование α-амнлазы, тождественной ферменту, образующемуся при прорастании нормального зерна.
При изучении процесса повышения активности α-амилазы в эндосперме пшеницы, лишенной зародыша, было показано, что здесь происходит биосинтез ферментного белка под влиянием гиббереллина, а не только переход его из связанной формы в активную, как предполагали ранее. Добавлением в гомогенизат эндосперма препаратов ДНК-азы и РНК-азы (выделенных из зародыша пшеницы) оказалось возможным подавить образование α-амилазы. Если эндосперм пшеницы обработать препаратами ДНК-азы и РНК-азы в течение 20 ч, а затем прибавить гиббереллин, то вообще не наблюдается активности α-амилазы. Предполагают, что ДНК-аза и РНК-аза разрушают полинуклеотидные цепочки соответствующих нуклеиновых кислот эндосперма, вызывая тем самым торможение синтеза белка α-амилазы. В том же направлении действует хлорамфеникол, широко применяемый для подавления синтеза белка. Эти данные подтверждают предположение, что под действием гиббереллина происходит синтез белкаα-амилазы.
Исследование изоэнзимов α-амилазы прорастающего зерна злаков проводилось неоднократно. При изучении зерновки пшеницы, прораставшей от одного до семи дней методом электрофореза в полиакриламидном геле, было установлено, что на второй день прорастания можно обнаружить две группы изоэнзимов. Одна из них, электрофоретически более подвижная, состоит из трех изоэнзимов: α1, α2 и α3; она идентична амилазам, найденным в созревающем зерне. Максимальная активность группы проявляется на четвертый день прорастания. Эти изоэнзимы не изменяют своей подвижности в течение всего периода прорастания. Вторая группа изоэнзимов характеризуется меньшей электрофоретической подвижностью: на второй день прорастания видны две близко расположенные двойные полосы, но в дальнейшем они меняют свою подвижность и проявляются в виде пяти полос. Таким образом, при прорастании появляются новые компоненты a-амилазы, отличающиеся от тех, которые находились в созревающей зерновке. Вероятно, эти компоненты синтезируются вновь под воздействием гиббереллинов. Эти данные были использованы для решения вопроса о причинах неудовлетворительного качества некоторых образцов товарной пшеницы США, которые характеризовались пониженной высотой амилограммы. В подавляющем большинстве образцов методом электрофореза в полиакриламидном геле было обнаружено присутствие изоэнзимов α-амилазы, характерных для проросшего зерна, и только в одном образце — изоэнзимов, характерных для недозревшего зерна. Активная α-амилаза была обнаружена во всех образцах, имевших максимальную высоту амилограммы ниже 500 единиц Брабендера.
Большой интерес и несомненное практическое значение имеют данные, сопоставляющие термоустойчивость α-амилазы проросшей пшеницы с тем же ферментом непроросшего зерна. Выяснилось, что последняя значительно более термолабильна, чем первая. Иначе говоря, инактивирование амилазы проросшего зерна требует более высокой температуры и продолжительного термического воздействия.
Проведенное исследование α-амилазы проросшей пшеницы, пшеничного солода, полученного проращиванием и последующим томлением при 49° С в течение 20 ч, и недозревшей пшеницы выявило довольно значительные различия в их компонентном составе. Концентрированные препараты α-амилазы (после осаждения инертных белков насыщенным раствором сульфата аммония) фракционировали на колонке Биогель-150, α-амилаза несозревшего зерна и пшеничного солода обнаруживает один четкий пик, тогда как амилаза проросшего зерна обнаруживает, кроме этого пика, еще один в области компонентов большей молекулярной массы. Амилаза солода дает еще и второй, менее четко выраженный пик, которого нет у препаратов этого фермента недозревшей и проросшей пшеницы.
В прорастающей зерновке разных сортов овса обнаружено три группы α-амилазы. В первой группе (А) находятся три изоэнзима амилазы довольно слабой активности, во второй (Б) — от двух до четырех изоэнзимов высокой активности в зависимости от сорта овса. В третьей группе (В) обнаруживаются два или три компонента слабой активности, а в некоторых сортах эти компоненты отсутствуют совсем. При сопоставлении этих электрофореграмм с аналогичными, полученными из непроросшего зерна, видно, что в последнем также имеется два активных компонента в группе Б и два менее активных в группе В. При изучении этих компонентов выяснили, что нагрев вытяжки из проросшего зерна не влияет на активность α-амилазы этой группы. Она оказалась очень термоустойчивой в отличие от тех же ферментов нормального зерна. Аналогичная закономерность установлена и для проросшей пшеницы.
В процессе прорастания зерна злаков значительно повышается активность β-амилазы и изменяется ее состав. Вытяжки из ячменя и ячменного солода при гельфильтрации на КМЦ значительно различаются. При прорастании образуются по крайней мере четыре изоэнзима β-амилазы, отличающиеся от компонентов амилазы ячменя. Добавление к вытяжке тиоглицерина дает возможность более четко разделить эти компоненты, активность которых повышается по мере прорастания.
Эти данные позволяют предположить, что β-амилаза содержится в зерновке ячменя как высокомолекулярный полимер, диссоциирующий при прорастании с образованием молекул различной молекулярной массы и разного заряда. Подтверждение этой гипотезы было получено в опытах обработки вытяжки из зерна нормального ячменя тиоглицернном, восстанавливающим дисульфидные связи. В результате такой обработки проявляются два компонента β-амилазы, Один компонент исчезает уже на первый день прорастания, а второй, по-видимому, идентичен β-амилазе 3, которая сохраняется в течение всего периода прорастания.
В дальнейших работах этих же авторов препараты амилазы были получены в концентрированном виде путем повторной гельфильтрации на КМЦ.
При изучении механизма активации β-амилазы ячменя в процессе прорастания установили, что в нормальном зерне находится два типа зимогена β-амилазы (β-А)—растворимого и нерастворимого в солевых растворах, а также два типа зимогена, переходящего в раствор после обработки папаином и нерастворимого под действием этого фермента. Количество этих четырех зимогенов β-амилазы по мере прорастания уменьшается, соответственно увеличивается содержание растворимой активной β-амилазы. Обработка гиббереллиновой кислотой при прорастании ускоряет переход зимогена в активную форму, но не влияет на общее количество β-амилазы. Инкубация выделенного алейронового слоя ячменя в гиббереллиновой кислоте в течение пяти дней обусловливает заметное повышение осахаривающей способности, но в основном под действием α-амилазы. Эти данные позволяют сделать вывод, что активность β-амилазы повышается при прорастании главным образом в результате перехода зимогена в активную форму фермента, а не в результате синтеза активной β-амилазы.
В прорастающем зерне пшеницы, ячменя и других злаков была обнаружена инвертаза и установлено, что глюкоза, образовавшаяся в эндосперме из крахмала, вначале конвертируется в сахарозу, которая переходит в росток, где быстро окисляется. Отсюда вытекает и важная роль инвертазы в обмене веществ прорастающей зерновки. Наибольшая активность инвертазы ячменя в ростках, корешках и в зародыше.
В эндосперме этот фермент не был обнаружен. Между активностью α-амилазы и инвертазы прорастающего ячменя есть определенная связь. Наличие мальтозы, глюкозы и других низкомолекулярных сахаров тормозит активность фермента, Удаление низкомолекулярных сахаров путем синтеза сахарозы, транспортируемой в ростки и корешки, стимулирует активность α-амилазы в клетках алейронового слоя.
Изменение активности нескольких ферментных систем прорастающего зерна твердой пшеницы было детально изучено. Исследовали четыре гликолитическнх фермента (фруктозодифосфатальдолаза, глицеральдегид-3Ф-дегидрогеназа, фосфоглицераткинзза и пируваткиназа), два фермента пентозо-фосфатного цикла (глюкозо-6Ф-дегидрогеназа и фосфоглюконатдегидрогеназа), два фермента цикла трикарбоновых кислот (изоцитратдегидрогеназа и малатдегидрогеназа), а также ферменты аминокислотного метаболизма: глютаматоксалоацетаттрансаминаза и глютаматпируваттрансаминаза. При этом четко выяснилась тенденция к повышению активности всех этих ферментов при прорастании и оказалось возможным установить влияние солнечного света на процесс активизации некоторых ферментов. Так, фосфоглицераткиназа более активна, если зерно прорастает в темноте, тогда как фруктозодифосфатальдолаза более активна при дневном свете.
Наряду с другими гидролазами активируется при прорастании зерна злаков и липаза. В зерновке овса, которая содержит гораздо больше липидов, чем другие злаки, активность липазы в покоящемся зерне также очень высока и повышается еще сильнее при прорастании.
Существенные результаты были получены при исследовании активности липазы пшеницы, проращиваемой в темноте и на солнечном свету при разной температуре. Субстратом служило оливковое масло в виде сильно разведенной эмульсии (метод Денуэля) или в виде полужидкой эмульсии влажностью около 20% (метод Роте). Активность фермента выражалась в микроэквивалентах олеиновой кислоты, выделенной в 1 мин на 1 мг сухого вещества ферментного препарата. За основу характеристики степени прорастания принимали длину ростка зерна, проращиваемого в асептических условиях как в темноте, так и на свету при температуре 15 и 30° С. На рисунке 74 представлен ход изменения активности липазы по мере увеличения размеров ростка при разных условиях проращивания.

Очень четко определяется зависимость активности липазы под действием света: в прорастающих в темноте зернах непрерывно повышается активность фермента по мере прорастания, а в прорастающих на свету зернах активность липазы увеличивается на ранних этапах, а затем стабилизируется на более низком уровне, чем у зерен первой группы.
Биологическое значение этого факта можно объяснить тем, что зерна, прорастающие на свету, вскоре начинают использовать солнечную энергию для процессов синтеза веществ в ростке, тогда как при прорастании в темноте этого важного источника энергии нет, и его частично компенсирует энергия, получаемая при окислении продуктов гидролиза жира. Практическое значение этих наблюдений заключается в том, что они подтверждают интенсивный ход гидролиза липидов влажного зерна, прорастающего в толстом слое, т. е. в отсутствии солнечного света. Следовательно, в практике хранения больших количеств зерна есть все условия для наиболее интенсивного гидролиза жира. Из приведенных графиков также видно, что увеличение температуры от 15 до 30° С значительно ускоряет повышение активности липазы при прорастании.
Наибольшая концентрация липазы в ростке, наименьшая — в корешках, и очень незначительное количество ее находится в остальных частях зерна.
Повышение активности фосфатаз при прорастании зерна злаков отмечали неоднократно, так же как и постепенное уменьшение содержания фосфолипидов и фитина.
Внимание технологов привлекает вопрос об изменении активности окислительных ферментов зерна злаков и особенно полифенолоксидазы в процессе прорастания. Полученные данные свидетельствуют, что при этом не только повышается активность полифенолоксидазы, пероксидазы и каталазы, но и изменяется изоэнзимный состав. При асептическом проращивании пшеницы в экстрактах было обнаружено закономерное увеличение количества изоэнзимов, начиная от первого дня и до четвертого. Покоящееся зерно дает при электрофорезе в полиакриламидном геле по одной полосе пероксидазы, полифенолоксидазы и каталазы. После первых суток прорастания появляется еще один компонент, через 48 ч у полифенолоксидазы и каталазы обнаруживается еще три полосы, у пероксидазы — четыре полосы. Через 72 ч прорастания у полифенолоксидазы наблюдается шесть компонентов, у пероксидазы — четыре, у каталазы — четыре. При этом повышается и активность этих ферментов. Вероятно, увеличение числа компонентов происходит вторичным путем, то есть синтезом новых форм ферментного белка. Данные о суммарной протеолитической активности вытяжек из зерна пшеницы разных стадий прорастания показывают, что активность вытяжки зерна четырехсуточного прорастания повышается почти в 10 раз по сравнению с покоящимся зерном. Аналогичные данные получены также и при изучении процесса прорастания зерновки риса. В этих исследованиях, так же как и в предыдущих, не был затронут вопрос об изоэнзимах протеаз и возможных их изменениях при прорастании.
Существенный интерес представляет вопрос о повышении активности глютатионредуктазы зерна пшеницы при его прорастании. Активность фермента возрастает в два с половиной раза. Сопоставляя эти данные с изменением качества клейковины прорастающего зерна, можно предположить взаимосвязь этих явлений. К сожалению, вопрос о воздействии глютатионредуктазы на белки пшеницы пока не подвергали дальнейшему исследованию.
Процесс прорастания сопровождается значительным повышением активности всех ферментных систем зерна. Однако внешние условия (температура, солнечный свет) оказывают огромное влияние на скорость активации ферментов. В практике уборки и хранения зерна эти условия настолько разнообразны и постоянно изменяются (например, в результате интенсивного дыхания прорастающего зерна температура насыпи часто возрастает), что предсказать степень повышения активности различных ферментов в проросшем зерне затруднительно. Принципиальное значение имеет изменение изоэнзимного состава при прорастании, так как при этом могут измениться свойства фермента. Примером этого является полифенолоксидаза, которая в проросшем зерне приобретает способность окислять тирозин. В покоящемся зерне этого нет.
Совершенно недостаточны сведения об активизации протеаз при прорастании. Несомненно, что причиной этого являются трудности с подбором соответствующего субстрата.