Накопление азотистых соединений и синтез белков при созревании пшеницы

29.10.2014

Co времени классических работ Недокучаева, показавшего, что в зерне пшеницы по мере созревания накапливается белковый азот в результате снижения содержания аминокислот и амидов. этот вопрос неоднократно исследовали. В обзорах обобщены соответствующие данные. Из недавних работ большого внимания заслуживают исследования, в которых сопоставляли накопление общего и белкового азота с изменением аминокислотного состава белков созревающего зерна пшеницы. Наряду с этим определяли и отдельные фракции углеводов.
Отдельно изучали эндосперм и фракцию оболочек (плодовую оболочку и перикарпий). Рассматривая приведенные материалы, следует учесть, что данные анализов созревающей зерновки выражают двояко: в абсолютных величинах на одну зерновку в микрограммах и в миллиграммах и в относительных — в процентах на сухую массу зерновки. На рисунке 71 представлено типичное для пшеницы увеличение сырой и сухой массы зерновки при созревании и постепенное накопление в ней белка. Там же показаны изменения относительного содержания воды и азота. Относительное содержание азота (в процентах на сухую массу) на определенном этапе снижается в результате быстрого накопления крахмала, чтобы на последней стадии вновь повыситься. Накопление азотистых веществ идет непрерывно, вплоть до сорокового дня с момента цветения, и также непрерывно протекает синтез белков. Относительное содержание общего и белкового азота несколько падает в период интенсивного накопления углеводов, но затем стабилизируется. Синтез белка идет наиболее быстро в первый период созревания, а затем его темп снижается. Поступление пластических веществ, в том числе азотистых соединений, в зерновку прекращается в фазе восковой спелости, но превращение их в белки продолжается до наступления полной спелости, характеризующейся низким содержанием влаги в зерновке.

Накопление азотистых соединений и синтез белков при созревании пшеницы

В дальнейшем исследовали изменение содержания различных белковых фракций созревающего зерна. В качестве растворителей применяли пирофосфат натрия (0,1M, pH 7,4), 0,05М раствор уксусной кислоты и 0,1M раствор едкого натра. Растворенный в пирофосфате белок хроматографировали на колонке с ДЭАЭ-целлюлезой, уксуснокислый раствор — на КМЦ. По мере созревания происходит быстрое увеличение содержания всех трех фракций белков. При этом большая часть повышения обусловлена увеличением содержания белков, растворимых в уксусной кислоте, т. е. глиадина и глютенина. Все эти фракции одновременно находятся уже на самых ранних стадиях созревания зерна. Ранее предполагали, что глиадин формируется позднее, чем глютенин. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлезе и КМЦ обнаруживает только количественные различия в белковых фракциях, профили элюции одинаковы для зерна на всех стадиях спелости.
Количественные соотношения получаемых фракций, растворимых в пирофосфате, для изученных сортов пшеницы (два сорта мягкой пшеницы —Габо и Инсинья, и один сорт твердой — Дурал) показали, что по мере созревания происходит заметное увеличение пиков А и Д. Однако при электрофорезе все фракции, получаемые ионообменной хроматографией как пирофосфатных, так и уксуснокислых растворов, обнаруживают значительную гетерогенность. Количественное их соотношение для каждого сорта пшеницы остается постоянным, кроме фракции К пирофосфатного раствора, представляющей собой остаток на хроматографической колонке и растворимой только в 0,1M растворе едкого натра.
Для дальнейшей идентификации белков, накапливающихся в эндосперме созревающей пшеницы, применяли электрофорез в крахмальном геле. При этом выяснилось, что в белках, растворенных в пирофосфате и уксусной кислоте, присутствуют одни и те же компоненты на всех стадиях развития зерновки, начиная с восемнадцатого дня после оплодотворения и до полной спелости. Для растворов белков зерна самой ранней стадии характерно отсутствие медленно движущихся компонентов в случае растворимых в пирофосфате белков и большее количество быстро движущихся компонентов во фракции, растворимой в уксусной кислоте.
Чтобы выяснить возможные взаимоотношения отдельных компонентов белков созревающей зерновки, провели исследования процесса включения радиоактивных изотопов в белки. Через 20 дней после цветения колосья срезали и помещали на 3—24 ч в раствор сульфата 35S. Это привело к быстрому включению метчика в белковые фракции зерна. Радиоавтография белковых компонентов, разделенных электрофорезом, подтверждает, что изотоп включен в каждый из этих составляющих. Отдельно проведенные опыты показали, что ход синтеза белков у срезанных колосьев не отличался от такового у колосьев на корню.
Суммарная радиоактивность уксуснокислых растворов белков выше, чем пирофосфатных растворов, однако удельная активность у первых ниже. Это указывает на то, что синтез белков, растворимых в уксусной кислоте, происходит быстрее, чем включение в них 35S. Кроме того, известно, что глобулины пшеницы содержат больше серу содержащих аминокислот, чем глютенин, и это тоже должно было повлиять на включение радиоактивного сульфата натрия во фракцию, экстрагируемую пирофосфатом. Применение меченного по 14C глицина вместо меченного по 35S сульфата обнаружило такие же различия в удельной активности растворов белка в пирофосфате и уксусной кислоте: активность последних была ниже, чем первых (табл. 141). Расчет удельной активности дает лучшее представление о взаимоотношениях растворимых в уксусной кислоте и пирофосфате натрия белков зерна, чем пересчет на общее содержание серы или углерода в белке.
Накопление азотистых соединений и синтез белков при созревании пшеницы

Опыты инъекции меченных по 14C глютаминовой кислоты и глютамина в растение пшеницы показали, что основная часть этих веществ превращается в пролин и сосредоточивается в клейковине зрелого зерна. В отличие от этих азотистых соединений аргинин, меченный по 14С, не претерпевает никаких превращений, обнаруживаясь как таковой в белках зерновки.
Позднее было показано, что ацетат натрия, содержащий 14C, быстро используется при синтезе белков зерна пшеницы. Изотоп углерода находится сначала во фракции растворимых белков, а затем в клейковине.
Эти данные, однако, не отвечают на вопрос, происходит ли синтез клейковинных белков одновременно и независимо от синтеза альбуминов и глобулинов или же последние являются предшественниками первых. Этот вопрос специально изучали при исследовании синтеза клейковины в созревающем зерне пшеницы. По мере созревания зерновки происходит не только увеличение содержания белкового азота, но и перераспределение его фракций.
Постепенно уменьшается относительное содержание легко растворимой фракции белка (растворимой в 5%-ном растворе сернокислого калия), обозначаемой как глобулиновая, и повышается содержание растворимой в 70%-ном растворе этанола и в 0,1 н. растворе едкого натра, т. е. глиадина и глютенина. Если в начале формирования зерновки глобулины составляли около 86% всего количества растворимого белка, то в середине молочной спелости их относительное содержание было только около 50%, а в фазе восковой спелости 30%. За счет этого увеличилось количество глиадина и глютенина.
В этих же исследованиях использовали своеобразную методику для выяснения вопроса, находятся ли клейковинные белки в эндосперме пшеницы в свободном состоянии или же с самого начала процесса созревания они связаны в комплекс клейковины, как в отмытой клейковине муки из созревшего зерна. Применили фракционирование белков созревающего зерна пшеницы следующими растворителями: 5%-ным раствором сернокислого натрия, 70%-ным раствором этанола, 0,01М раствором едкого калия и 12%-ным раствором салицилата натрия в различной последовательности. Предварительно установили, что водный раствор салицилата хорошо растворяет клейковину и глиадин, но почти не растворяет глютенин. Так, непосредственно из муки салицилат извлекает около 90% присутствующей в ней клейковины. Если же предварительно удалить из муки глиадин водным этанолом, то подавляющая часть оставшегося глютенина уже не может быть извлечена салицилатом. Таким образом, по растворимости глютенина вводном растворе салицилата можно судить о том, находится ли глютенин в свободном состоянии или он входит в состав клейковинного комплекса. Для анализа отдельные навески созревающего зерна экстрагировали, применяя следующие варианты:
Накопление азотистых соединений и синтез белков при созревании пшеницы

По первому варианту определяют содержание глиадина и глютенина в зерне обычным способом (после удаления альбуминов и глобулинов). Данные анализа по второму варианту позволяют судить о том, находится ли глютенин в зерне в свободном виде или он входит в комплекс клейковины. В последнем случае сумма глиадина и глютенина, определяемая по первому варианту, должна совпадать с количеством белка, извлекаемого салицилатом, поскольку он растворяет практически всю клейковину. С самого раннего периода созревания зерна глиадин и глютенин образуют комплекс, подобный клейковине по растворимости в салицилате, так как сумма глиадина и глютенина и количество белка, извлекаемого салицилатом, практически равны. Применяя тонкое измельчение и выделение промежуточного белка по методу Гесса, было получено небольшое количество клейковины даже из зерновки зеленой спелости.
По мере созревания содержание клейковины в зерновке повышается.
По своему качеству клейковина зерна на разных фазах его развития заметно различается. Она формируется в связный комок с трудом, получается короткорвущейся, а нормальные реологические свойства приобретает только в фазе восковой спелости зерновки. Вероятно, здесь влияют свободные жирные кислоты, которые еще не вошли в состав триглицеридов липидной фракции.
В дальнейшем подтвердилось, что глиадин и глютенин формируются уже на ранних стадиях созревания зерновки. Методика, применяемая для этого исследования, состояла в растворении суммы белков в смеси растворов О,IM уксусной кислоты, 3М мочевины и 0,01M цетилтриметил-бромида аммония. Эта смесь экстрагирует белки почти полностью. Полученный раствор подвергали гельфильтрации на Ceфадекс Г-150 и молекулярную массу фракций идентифицировали по белкам известной молекулярной массы ниже 10 000. По мере созревания зерновки относительное содержание глиадина и глютенина повышается, а альбуминовой фракции — понижается. Заметно также уменьшается и содержание низкомолекулярной фракции азотистых веществ.
Полученные кривые гельфильтрации обнаружили еще одно явление до сих пор неизвестное — белки в зерне мягкой пшеницы, достигшей полной спелости, дают во фракции высокомолекулярных белков два дополнительных пика, соответствующих молекулярной массе 20 000—500 000. Белки твердой пшеницы (сорт Стьюарт) не имеют таких пиков. Появление дополнительных пиков соответствует фазе спелости, на которой в полной мере обнаруживаются высокие хлебопекарные свойства пшеницы, что позволяет авторам сделать предположение о большом значении этих фракций глютенина для свойств пшеничного теста. При ультрацентрифугировании растворов белка обнаруживается только один пик, соответствующий альбуминам и глиадину. Коэффициент седиментации постоянно увеличивается по мере созревания, что можно объяснить изменением соотношения альбумина и глиадина в сторону снижения последнего. В недавних исследованиях изучали соотношение белковых фракций в зерне пшеницы, начиная от восковой спелости, в сопоставлении с количеством отмываемой из зерна клейковины. Содержание сырой и сухой клейковины в зерне в период от восковой до полной фазы спелости увеличивается. Одновременно несколько увеличиваются фракции глютенинов и глобулинов. Соотношение глиадина и глютенина по мере созревания понижается. Вместе с этим происходит некоторое укрепление клейковины и заметно увеличивается сила муки, определяемая по альвеографу, и величина водопоглотительной способности. Разжижение теста, учитываемое при замесе его в фаринографе, уменьшается, то есть по мере созревания повышаются хлебопекарные достоинства пшеничной муки. Существенное значение имеет вопрос о том, в какой мере могут изменяться содержание и свойства клейковины при дозревании пшеницы в валках при раздельной уборке. Эти изменения зависят прежде всего от состояния зерновок в момент раздельной уборки. Большое влияние на процессы дозревания в валках оказывают температура и относительная влажность воздуха.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: