Сортовая специфичность полифенолоксидазы
При изучении технологических свойств сортов пшеницы, произрастающих в Индии, обратили внимание на то, что тесто из недавно введенных в посевы карликовых мексиканских пшениц очень быстро темнеет и полученные из него пресные лепешки (чапати) имеют неприятный темный цвет. Индийские исследователи изучали процесс потемнения теста из цельносмолотого зерна пшеницы разных сортов, из муки лабораторного помола тех же пшениц и полученные данные сопоставляли с активностью полифенолоксидазы и цветом фенольной пробы. Определение активности полифенолоксидазы, проводившееся по методу Горовица с применением ДОПА в качестве субстрата, обнаружило резкие различия между сортами. Индийские сорта пшеницы, тесто из которых в процессе отлежки сохраняло свой светлый цвет, имеют величину активности полифенолоксидазы во много раз меньше, чем мексиканские сорта, дающие темное тесто. Активность фермента может быть подавлена термической обработкой увлажненного зерна при его прогреве до температуры 100°C. Добавление в тесто специфических ингибиторов полифенолоксидазы, в частности диэтилдитиокарбамата, дающего хелатное соединение с медью, полностью инактивирует фермент, вследствие чего тесто сохраняет свой цвет.
Для выяснения, не лимитируется ли активность полифенолоксидазы недостатком фенольных соединений, в тесто добавляли различные вещества: l-тирозии, ДОПА, пирокатехин. Установили, что образцы теста из индийских пшениц сохраняют светлый цвет и при добавлении избытка субстрата для полифенолоксидазы. Следовательно, именно низкая активность фермента обусловливает стабильность цвета. Иную картину наблюдали при добавлении тех же веществ в тесто из мексиканских сортов пшениц. В этом случае интенсивное потемнение теста обнаруживается уже через 30 мин отлежки, тогда как без добавления субстрата полифенолоксидазы потемнение начинается намного позже. Таким образом, в этой группе сортов, обладающих высокой активностью полифенолоксидазы, недостаточно субстрата для ее действия.
Пшеничная мука 70%-ного выхода, полученная на лабораторной мельнице, образует тесто, не темнеющее при отлежке. Очевидно, полифенолоксидаза сконцентрирована в тех анатомических частях зерновки, которые удаляются при помоле. Прямое доказательство такого распределения фермента было получено ранее при сопоставлении активности полифенолоксидазы и других оксидоредуктаз в продуктах помола различных сортов пшениц.
При дальнейшем изучении причин потемнения теста в экстрактах цельносмолотых зерен, кроме активности полнфенолоксидазы, определяли общее содержание фенолов и l-тирозина. Определение суммы фенолов методом тонкослойной хроматографии показало, что в пшеницах, дающих тесто нормальное и темнеющее, качественных различий в фенольных соединениях нет, на всех хроматограммах присутствует по 13 компонентов, тождественных по положению на хроматограмме. В количественном их содержании отмечена значительная разница как по сумме фенолов, так и по тирозину (табл. 138). Более высокая активность полифенолоксидазы мексиканских сортов пшеницы сочетается с большим содержанием суммы фенолов и тирозина. Очень важно было установить, нет ли в индийских сортах пшеницы природных ингибиторов полифенолоксидазы. Были проведены опыты, в которых добавляли вытяжки из этой пшеницы к экстрактам из мексиканских сортов пшеницы, дающей темнеющее тесто. Образование продуктов окисления фенолов при этом протекало так же интенсивно, как и без прибавления вытяжек. Следовательно, в индийских сортах пшеницы ингибитор полифенолоксидазы ие обнаруживается.
Данные, характеризующие активность полифенолоксидазы различных видов пшеницы, представлены в таблице 139. Высокой активностью этого фермента отличается пшеница твердая, картлинская и дикоккум, причем отмечена положительная корреляция с цветом фенольной пробы.
Концентрированные вытяжки зерна индийской и мексиканской пшеницы были подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле. При этом были выявлены качественные различия между ними. Ферменты мексиканской пшеницы разделяются на пять изоферментов; полосы двух особенно интенсивны, они характеризуют высокую активность полифенолоксидазы.
Препараты индийских сортов обнаруживают только три компонента и значительно меньшей интенсивности. Следует отметить, что при проявлении электрофореграмм четко выраженные полосы были получены только при применении в качестве субстрата ДОПА. Тирозин и катехин не подвергались достаточно сильному воздействию полифенолоксидазы в среде полиакриламидного геля.
Для более подробного исследования полифенолоксидазы пшеницы были получены концентрированные препараты фермента из экстрактов пшеничных отрубей. Для определения специфичности полифенолоксидазы применяли следующие субстраты: монофенол (l-тирозин концентрацией 0,18 мг/мл), дифенолы (ДОПА, пирокатехин, ДОПАмин, кофейная кислота) и трифенол (хлорогеновая кислота), в фосфатном буфере pH 6,0. Активность фермента определяли колориметрически и выражали повышением оптической плотности раствора при длине волны λ=280 им для монофенолов и λ=340 нм для
полифенолов. Ферментные препараты из пшеницы, дающей темнеющее тесто, имеют высокую активность полифенолоксидазы по отношению к пирокатехину, ДОПА и ДОПАмину, однако совершенно не действуют на хлорогеновую кислоту и l-тирозин (рис. 70). Активность препаратов, выделенных из пшеницы, тесто которых сохраняет свой светлый цвет, в несколько раз меньше, но и в этом случае фермент не влияет на тирозин и хлорогеновую кислоту. Эти данные противоречат результатам предыдущих исследований. Однако оказалось, что при отволаживании замоченного зерна пшеницы в течение нескольких часов вытяжки из него приобретают способность воздействовать на тирозин, окисляя его в меланины. Вероятно, при этих условиях наступают первые стадии прорастания зерна и появления новых форм изоэнзимов полифенолоксидазы, способных окислять тирозин. Очевидно, в исследованных ранее образцах и находились зерна, прошедшие эти стадии.
При изучении термостабильности фермента также были обнаружены существенные различия между сортами пшеницы, дающими нормальное или темнеющее тесто. У первых при нагревании вытяжки в течение 1 ч при температуре 60°С, уровень активности понижается до 48—54%, у последних сохраняется от 80 до 85% активности полифенолоксидазы.
Электрофорез растворов, содержащих фермент, с последующим проявлением полос различными субстратами также выявил сортовые различия пшеницы. Только ДОПА давала окраску, характеризующую присутствие полифенолоксидазы при этих условиях. Сорта карликовой пшеницы, дающей темнеющее тесто, характеризовались наличием трех — четырех полос, т. е. содержанием трех — четырех энзим полифенолоксидазы во фракции, которая не сорбируется гелем фосфата кальция. Фракция, элюированная с геля фосфата, давала четыре — пять полос. Вытяжки нормальной пшеницы обнаруживали в первой фракции три полосы, но иначе расположенные, чем у карликовой пшеницы, и пять менее сильно выраженных полос в элюате. При хранении растворов, содержащих фермент, в течение шести дней при температуре 4°С обе фракции фермента карликовой пшеницы проявили значительную устойчивость, сохраняя, хотя и в ослабленном виде, специфические полосы изоэнзимов, тогда как у пшеницы индийских сортов полифенолоксидаза исчезала совсем. В этом случае происходила или полная деструкция фермента при длительном пребывании в растворе, или же он переходил в латентное состояние.
Во Франции для выработки макаронных изделий начали сеять некоторые американские сорта твердой пшеницы, крупки из которых часто дают темнеющее тесто. Для выяснения возможного влияния полифенолоксидазы на процесс потемнения исследовали 54 образца твердой пшеницы, произраставших в южных районах страны. Активность полифенолоксидазы и второго окислительного фермента — пероксидазы — определяли двумя методами: непосредственно в водных растворах измельченного зерна и после электрофореза этих вытяжек в полиакриламидном геле при двух вариантах кислотности: pH 3,2 и pH 8,6. Для полифенолоксидазы применяли спектрофотометрическое определение цвета продуктов окисления пирокатехина. Активность пероксидазы определяли спектрофотометрически при добавлении в раствор гваякола и перекиси водорода при длине волны λ=465 нм.
Полученные величины активности ферментов по двум вариантам опыта подвергали математической обработке, чтобы выяснить, насколько совпадают данные этих методов определения. У величин активности пероксидазы, полученных тем и другим методом, коэффициент корреляции близок к единице.
Иная картина наблюдается для полифенолоксидазы: применяемые методы дают несопоставимые результаты. Между величинами активности этого фермента, определяемыми непосредственно в водной вытяжке и после электрофореза, обнаруживается отрицательная зависимость. Очевидно, в водном экстракте протекает побочное окисление пирокатехина или в нем содержатся ингибиторы этого фермента,
При электрофорезе в полиакриламидном геле реакция окисления пирокатехина протекает в зависимости от активности только полифенолоксидазы.
Сопоставление активности пероксидазы и полифенолоксидазы, определяемых двумя методами, показало, что тесная положительная корреляция величины активности обоих ферментов наблюдается только при применении метода электрофореза в двух вариантах кислотности. Была показана тесная корреляция между степенью потемнения макаронного теста (величина индекса коричневого цвета) и активностью как полифенолоксидазы, так и пероксидазы. Чем выше активность этих ферментов в муке, тем темнее получаются макароны.
Электрофорез обоих ферментов обнаружил почти полную тождественность получаемого спектра, состоящего у разных сортов из 1—3 полос. Это дало возможность выдвинуть гипотезу о том, что носителем пероксидазы и полифенолоксидазы является один и тот же белок.
Полифенолоксидазы других злаков изучены мало. При сравнительном исследовании активности фермента установили, что ячмень и пшеница содержат его в заметных количествах в зерне нормальном, тогда как в зерне кукурузы и риса полифенолоксидаза появляется только после прорастания. Представляют интерес данные, обнаружившие в водных растворах полифенолоксидазы специфический ингибитор, подавляющий ее активность.
Ингибитор можно удалить из вытяжки диализом, причем активность полифенолоксидазы заметно возрастает. В диализате обнаруживается ингибитор, добавление которого в раствор полностью инактивирует фермент. По-видимому, этот ингибитор не разрушается при действии тепла.