Свойства β-амилазы

29.10.2014

β-амилаза растворима в воде и солевых растворах, но при кратковременной экстракции растворяется не весь фермент — значительная его часть находится в связанном состоянии и может быть извлечена только при продолжительном автолизе водно-мучной суспензии или воздействия протеаз. По мере автолиза все большее количество β-амилазы переходит в свободное состояние. Соотношение свободной и связанной β-амилазы подвержено значительным колебаниям. По ранним данным, около % всей β-амилазы пшеницы находится в связанном (латентном) состоянии.
В исследованиях биохимии пшеницы Казахстана было показано, что количество связанной β-амилазы может достигать до 80% ее общего количества. Для перевода ее в активное состояние требуется 24-часовое переваривание мучной суспензии папаином (табл. 131). Ho как в отношении суммарной активности, так и в соотношениях свободной и связанной β-амилазы отмечены довольно широкие пределы колебаний, обусловленные, вероятно, состоянием зерна. Было показано, что в зерне пшеницы ранней молочной спелости вся β-амилаза переходит в раствор, но по мере созревания все большая часть фермента становится нерастворимой и требуется продолжительный автолиз или обработка протеазами для ее извлечения (табл. 132). Повышается количество β-амилазы, переходящей в раствор и при воздействии веществ, восстанавливающих дисульфидные связи белка. Это заставило предположить, что между ферментом и глютенином имеются дисульфидные мостики, разрушение которых переводит β-амилазу в активное состояние.

Свойства β-амилазы

β-амилаза пшеницы получена в кристаллическом виде и хорошо изучена. При осаждении из растворов она образует правильные, несколько удлиненные сферические тела, отличающиеся от обычных белковых кристаллов. Фермент извлекается из муки 10%-ным раствором хлористого натрия. После предварительной очистки осаждением сульфатом аммония β-амилазу можно фракционировать на колонке ДЭАЭ-целлюлозе На три основных и два дополнительных компонента, содержащих активный фермент. При добавлении к солевому раствору глютатиона содержание β-амилазы в растворе значительно повышается, но при этом глютатион не влияет на распределение компонентов при хроматографировании. Вероятно, при обработке глютатионом происходит освобождение связанной с белком амилазы.
Свойства β-амилазы

Получаемые при хроматографировании на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой три фракции β-амилазы значительно отличаются одна от другой величиной оптимального pH, а также своей активностью (табл. 133). Установлен также аминокислотный состав этих фракций. Обработка раствора фермента KJO3 не влияла на его активность и не изменяла константу седиментации при ультрацентрифугировании. Последнее указывает на то, что под действием окислителя либо не образовывались новые дисульфидные связи между макромолекулами, либо они образовывались внутри молекул. Добавление к ферментному раствору веществ, связывающих сульфгидрильные группы (J-ацетат или N-этилмалеимнд) также не оказывало влияния на вктивность фермента. Полное ингибирование р-амилазы отмечалось только при обработке ее раствора солями ртути.
Свойства β-амилазы

Изучение свободной и связанной β-амилазы пшеницы показало, что при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе обе обнаруживают по два главных компонента, которые сходны между собой.
В этих исследованиях под свободной амилазой подразумевалась ее форма, растворимая в воде или в 1,0%-ном растворе хлористого натрия. Связанной (латентной) обозначалась та ее форма, которая растворялась в воде после обработки глютенина восстановителями, в частности 1,24 M раствором тиоглицерина.
Обстоятельно изучали также β-амилазу ячменя. При этом было показано, что методом гельфильтрации на Сефадекс Г-100 ее можно разделить на четыре фракции возрастающей молекулярной массы, обозначенные как A4-A1. Применение иммунохимического метода обнаружило их полную идентичность.
При хранении нефракционированного экстракта в течение нескольких дней наблюдается смещение пиков, получаемых при гельфильтрации на Сефадекс. Это указывает на то, что при данных условиях происходит расщепление белков большей молекулярной массы.
Аналогичная картина обнаруживается в процессе прорастания ячменя: активность фракции наименьшей молекулярной массы возрастает при соответствующем понижении активности фракций большей молекулярной массы.
Для сравнительного изучения β-амилазы пшеницы, ржи, ячменя и овса применяли экстракцию размолотого зерна фосфатным буфером pH 7,0, содержащим 2,5% хлористого натрия. Гельфильтрация на Сефадекс Г-100 показала четыре пика у ячменя, по два пика у пшеницы и ржи и один пик у овса. При хранении вытяжек в течение 3—10 дней при температуре 5° С обнаруживалось явное смещение пиков, свидетельствующее о расщеплении более высокомолекулярных белков на меньшие молекулы у амилазы ячменя, пшеницы и ржи, но не овса. Применение иммунохимического анализа со специфической сывороткой на β-амилазу ячменя показало, что β-амилазы пшеницы и ржи дают с ней дугу преципитации. Это свидетельствует о частичной идентичности белков β-амилазы пшеницы и ржи с ячменными. Амилаза овса не реагирует с этой сывороткой. Следует отметить, что триба овсовых стоит достаточно далеко от триба пшеничных. Структуры белков β-амилазы пшеницы, ржи и ячменя близки друг к другу, но не идентичны. Амилаза овса по свойствам белка далека от амилазы ячменя. Это подтверждает специфичность белков зерна представителей различных триб семейства злаков.
Существенное значение для технологии переработки зерна имеют температурный и кислотный оптимумы действия амилаз. В связи с этим представляет интерес величина температурного коэффициента действия амилаз, характеризующего зависимость скорости реакции ферментативного гидролиза субстрата от температуры среды.
Для ферментативного катализа характерно правило Вант-Гоффа, согласно которому при повышении температуры на 10°C скорость реакции возрастает в два — четыре раза. Это происходит в определенных границах температуры, так как увеличение ее сверх оптимальной обусловливает начало тепловой денатурации белков и, следовательно, инактивацию фермента.
Температурные коэффициенты и энергию активации для β-амилазы определяли неоднократно. В пределах 20—30°С температурный коэффициент для мягкой пшеницы выше, чем для твердой. Значительные колебания величины температурного коэффициента обнаруживаются при сопоставлении различных сортов пшеницы разных районов произрастания. Как и следовало ожидать, на величину температурного коэффициента влияет и значение температурного интервала, для которого определялся этот коэффициент.
Температурный оптимум действия β-амилазы пшеницы, ржи и ячменя лежит в пределах 48—51°С. Кислотный оптимум для β-амилазы пшеницы в определенной степени зависит от температуры (табл. 134). При более высокой температуре оптимальная кислотность сдвигается в менее кислую область.
Свойства β-амилазы

Ингибирующее воздействие на β-амилазу пшеницы оказывают вещества: соли цианистоводородной кислоты, аскорбиновая кислота, β-хлорбеизойная кислота, фенилмеркуроацетат. Ингибированная аскорбиновой кислотой β-амилаза реактивируется цистеином.
Ионы кальция понижают стабильность фермента в растворе. Ингибиторами амилаз являются также спирты в концентрациях 4—8 моль/г, причем наиболее активен этанол. Гидролиз крахмала α- и β-амилазами солода очень сильно стимулируется солями некоторых органических кислот, в том числе таких, которые могут находиться в бродящем тесте.
На интенсивность ферментативного гидролиза крахмала β-амилазой очень сильное влияние оказывает состояние самого субстрата. Нативные зерна крахмала поддаются гидролизу значительно меньше, чем клейстеризованные или же обработанные слабым раствором соляной кислоты, т. е. растворимые в воде. Клейстеризация повышает интенсивность осахаривания более чем в 30 раз. Аналогичные данные были получены при изучении ферментативного осахаривания крахмала твердых и мягких пшениц β-амилазой.
Вероятно, размеры зерен крахмала также имеют значение. Наиболее чувствительными к β-амилазе являются мелкие зерна, обладающие большей удельной поверхностью по сравнению с крупными.
Механическое повреждение наружных слоев крахмальных зерен приводит к резкому увеличению осахаривания под действием β-амилазы.
Ранее были получены интересные данные, показывающие, что гидролиз крахмала в водной суспензии муки лимитируется не содержанием фермента, а количеством самого крахмала, поддающегося действию β-амилазы. К различным навескам муки, собственные ферменты которой были предварительно инактивированы, добавляли одинаковое количество раствора β-амилазы. По мере увеличения навески муки при прочих равных условиях количество мальтозы, образовавшейся в суспензии, также возрастало. Это можно объяснить тем, что при увеличении навески муки повышалось и содержание крахмала, доступного β-амилазе. Гидролиз же очищенного крахмала, полученного из той же навески муки многократным промыванием водой, протекал гораздо слабее и не зависел от величины навески.
Таким образом, эффект воздействия β-амилазы на крахмал лимитирован содержанием подходящего субстрата. Присутствие в зерне или муке второго амилолитического фермента — α-амилазы — значительно изменяет картину, α-амилаза гидролизует крахмал с образованием низкополимеризованных продуктов, которые подвергаются осахариванию β-амилазой, во много раз интенсивнее, чем нативный крахмал. Таким образом, совместное воздействие α- и β-амилаз приводит к образованию большого количества мальтозы, чем при действии одной β-амилазы. Это было убедительно показано модельными опытами последовательного добавления к амилозе и амилопектину сначала β-амилазы, а затем α-амилазы. При этом гидролизовался практически весь крахмал, тогда как одна β-амилаза гидролизовала только около 64% его.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: