Протеолитические ферменты зерна
Несмотря на то, что протеазы имеют исключительно большое значение для технологии, они изучены значительно меньше, чем амилазы. Причина этого заключается в том, что классические методы изучения протеаз животного происхождения оказались малоэффективными при изучении ферментов зерна злаков. Определение активности пептидгидролаз и пептидилгидролаз по количеству освобождающихся при гидролизе аминных или карбоксильных групп при автолизе муки злаков позволило обнаружить лишь слабый гидролиз пептидных связей. Кроме того, при этом не обнаруживается закономерностей в зависимости между степенью гидролиза и изменением реологических свойств клейковины и теста. Изучение процесса разжижения клейковины проросшего зерна показало, что полная деградация ее наступает задолго до того, как оказывается возможным обнаружить прирост свободных аминных групп, или увеличение водорастворимого белка, или небелковых азотистых соединений. На основании этих данных было сделано предположение, что протеазы зерна не являются собственно гидролазами, т. е. что распад клейковинных белков не должен быть обусловлен гидролизом пептидных связей.
Более чувствительным методом обнаружения протеолиза белков пшеничной муки оказался метод определения прироста продуктов распада белков, неосаждаемых трихлоруксусной кислотой. Исследованиями автолиза водно-мучных суспензий этим методом установлена закономерная связь между накоплением азотистых веществ, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой, и изменением реологических свойств клейковины.
Однако эти данные не были должным образом использованы в дальнейших исследованиях, и при разработке более чувствительных методов изучения протеолиза было предложено определять воздействие протеаз зерна не на белки собственно, а на гемоглобин по видоизмененной методике Ансона — Мирского, широко применяемой в биохимии животных. Американская ассоциация зерновых химиков рекомендовала этот метод в модификации Эйр и Андерсона в качестве стандартного для исследования протеолитической активности зерна, муки и солода. Принцип его заключается в воздействии суспензии муки на раствор гемоглобина при pH 4,7. Активность ферментов выражается количеством азотистых веществ, образовавшихся за определенный срок протеолиза и не осаждаемых трихлоруксусной кислотой.
В последующем этот метод был подвергнут серьезной критике, обоснованной экспериментальными данными. Так, активность протеаз муки, определенную этим методом, сопоставляли с изменением реологических свойств клейковины. При этом было выявлено несоответствие между быстрым разжижением клейковины и очень слабым приростом небелковых азотистых веществ. На этом основании было высказано предположение, что в зерне пшеницы существует два типа протеаз: α-протеаза, обусловливающая быстрое изменение свойств клейковины, и β-протеаза, расщепляющая белковые вещества до продуктов, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой.
He меньшее значение для разработки адекватного метода определения протеолитической активности зерна злаков имеют данные сопоставления воздействия протеаз на гемоглобин и на белки зерна. При автолизе мучной суспензии происходит в четыре — пять раз меньшее накопление небелкового азота, чем при воздействии адекватного количества этой суспензии на гемоглобин. Иначе говоря, последний легче подвергается воздействию протеаз муки, чем ее собственные белки. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что метод Эйр—Андерсона не отражает должным образом активность протеаз зерновых по отношению к их собственным белкам. Тем не менее он широко применяется при исследованиях. Так, при исследовании методом Эйр—Андерсона образцов пшеницы оказалось возможным сопоставить распределение протеаз по фракциям, извлекаемым различными растворителями.
Распределение активности протеаз, извлекаемых из пшеничной муки различными растворителями, представлено в таблице 123. Наиболее активен экстракт, полученный обработкой муки уксусной кислотой, а наименее — водный экстракт. Значительная часть ферментов, гидролизующих гемоглобин, не переходит в раствор и обнаруживается в остатке после экстракции. Была также показана возможность получения концентрированных препаратов протеаз путем осаждения части белков, перешедших в уксуснокислый раствор, и конденсации оставшейся части. Таким способом удается повысить удельную активность фермента в четыре — пять раз (в пересчете на азот препарата). Гельфильтрация на Сефадекс Г-100 обнаружила в этих концентрированных препаратах один пик, в котором совпадали максимальная концентрация белка и максимальная активность фермента.
Опыты нагрева экстрактов до температуры 50° С обнаружили наличие в них по крайней мере двух форм ферментов: термостабильную, сохранявшую свою активность даже при двухчасовом нагреве при температуре 50° С, и термолабильную, теряющую активность при выдерживании при этой температуре в течение получаса. Термостабильная фракция составляет больше половины всех протеаз. При температуре 70° С происходит полная инактивация всех ферментов.
По этой же методике исследовали кислотный оптимум протеаз. В соответствии с данными более ранних работ было установлено, что оптимальная активность ферментов, извлекаемых из вытяжек муки, лежит в пределах pH 3,8-4,4. Следовательно, если принять, что ферменты зерна действуют при одинаковых условиях и на гемоглобин, и на белки зерна, то можно сделать вывод о том, что в условиях приготовления хлеба на дрожжах протеазы не могут полностью проявить свое воздействие, так как pH пшеничного дрожжевого теста находится в пределах 5,5-5,8,
Более благоприятные условия, очевидно, создаются при выработке пшеничного теста на жидких полуфабрикатах, активная кислотность которых значительно выше, и в еще большей степени при приготовлении ржаного теста на заквасках.
В ячмене и солоде было обнаружено не менее пяти пептидилпептидгидролаз, которые расщепляют желатин, гемоглобин и казеин.
Более подробное исследование показало, что эти гидролазы хорошо растворимы при pH 4,0-4,5 и при фильтрации через гель карбоксиметилцеллюлозы могут быть разделены на две фракции: одна адсорбируется на геле, другая остается в растворе. Первая фракция при гельфильтрации на Сефадекс Г-100 дает два пика: один с меньшей активностью и большей молекулярной массой и второй с меньшей молекулярной массой и большей протеолитической активностью (рис. 67). При повторном хроматографировании на том же геле второй фракции получается только один пик. Важно отметить, что в данном случае в качестве субстрата для определения активности фермента применяли не только гемоглобин, но и глиадин пшеницы. Последний также расщепляли до продуктов, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой, хотя и в. меньшей степени, чем гемоглобин. Фракция белков, несорбировавшаяся на КМЦ при повторной гельфильтрации последовательно на Сефадекс Г-100 и Г-75, дает три пика по активности. В таблице 124 приведена удельная активность выделенных фракций ферментов.
Наиболее концентрированной получается фракция, несорбируемая на КМЦ, особенно после ее выделения на Сефадекс Г-75. Кроме того, при гельфильтрации, сорбируемой на КМЦ фракции фермента на Сефадекс Г-100, полученные фракции I и II неидентичны по своему воздействию на гемоглобин и казеин.
Возможно, что в последней фракции отсутствует еще один фермент, гидролизующий казеин. Приведенные данные показывают, какое значение имеет правильный выбор субстрата для исследования протеолитической активности зерна злаков.
Стабильность выделенных ферментов после воздействия на них среды различной кислотности представлена в таблице 125.
Нефр акционированный фермент обнаруживает большую устойчивость при pH 4,0—4,6, но быстро теряет активность при pH 1.2-3,0, так же как и при pH 6,0—8,0.
Исходная смесь ферментов, несорбированная на КМЦ, быстро инактивируется при температуре 55°С: ее фракция I при этой температуре очень мало понижает свою активность в отличие от фракции II.
При сопоставлении активности протеаз зерна пшеницы, ржи и Тритикале видно, что наиболее активны протеазы ржи и ее гибридов (табл. 126). Это относится как к муке, так и к отрубям.
Изучение распределения протеолитической активности по продуктам помола Тритикале показало, что концентрация ферментов в отрубях и в зародыше в несколько раз выше, чем в эндосперме (табл. 127).
Зависимость активности протеаз от величины pH для пшеницы, ржи и Тритикале представлена на рисунке 68. По этим данным, кислотный оптимум для ферментов всех трех злаков лежит в границах pH 4—4,5.
Поиск новых способов учета активности протеаз зерна пшеницы и исследования их свойств продолжается.
Очень чувствительный метод определения активности протеаз — электрофорез вытяжек из муки или отдельных фракций этих вытяжек в крахмальном геле, содержащем гемоглобин. Последующая инкубация геля и окраска его нигрозином позволяет выявить белые полосы в местах концентрации протеаз, разрушивших гемоглобин. Этим способом были изучены протеазы, полученные при экстракции пшеничной муки различными растворителями. По электрофоретической подвижности оказалось возможным разделить их на четыре группы:
- группа А, обладающая наименьшей подвижностью и обнаруживаемая в виде широкой полосы на старте;
- группа В, несколько более подвижная, но имеющая меньшую протеолитическую активность;
- группа С, с большей подвижностью и наиболее высокой активностью;
- группа Д, наиболее подвижная и также мало активная. В каждой из этих групп можно различить по две — три полосы равной активности.
Изучение этим методом экстрактов, полученных последовательной обработкой муки водой, раствором 0,4М раствора хлористого натрия при pH 7,6 и этанолом, показало, что максимум ферментов извлекается 70%-ным раствором этанола, т. е. они содержатся во фракции клейковинных белков. Наименьшей активностью обладали водные и солевые вытяжки.
Непосредственная экстракция муки 0,05М раствором уксусной кислоты, растворяющей около 80% всех ее белков, как и предполагали, дала раствор протеаз с высокой активностью. Дальнейшие опыты показали, что растворением отмытой из муки клейковины в слабой уксусной кислоте с цистеином можно извлечь находящиеся в ней ферменты, которые обнаруживаются электрофорезом в крахмальном геле в виде полосы группы С, обладающей наибольшей активностью. Из этого следует, что протеазы в значительной степени связаны с клейковинными белками. Таким образом, применение более чувствительной методики подтвердило приведенные выше материалы.
Принципиально правильным является предложение учитывать активность протеаз по изменению свойств клейковины. Для этого служит прибор, аналогичный прибору УРК-1. В исследуемую клейковину добавляли препараты различных протеаз и следили за ее растяжением под тяжестью груза в течение 1—1,5 ч. Полученные данные выражали растяжимость клейковины в сантиметрах.
Эта методика показала, что и в контрольной клейковине при продолжительном (24 ч) автолизе также происходит увеличение ее растяжимости.
Эти данные, подтверждающие опубликованные ранее материалы, свидетельствуют, что процессы изменения реологических свойств клейковины обусловлены содержанием в ней протеаз. Далее было показано, что высокой способностью к разжижению клейковины обладают концентрированные препараты, полученные из проросшей пшеницы.
Наряду с этим изучали изменение растяжимости клейковины под действием препаратов различных протеаз растительного и животного происхождения. При этом было отмечено, что между активностью ферментного препарата, определенной методом Эйр — Андерсона, и степенью его воздействия на клейковину нет закономерной зависимости (рис. 69). Наиболее сильное воздействие оказывает препарат бромелина, обладающий наименьшей активностью по гемоглобиновому методу. Эти данные еще раз подтверждают, что метод Эйр—Андерсона мало пригоден для изучения протеаз и процессов протеолиза зерна злаков. Применение этого метода для характеристики протеолитической активности ферментных препаратов, применяемых в хлебопечении, также не дает полного представления о возможной степени их воздействия на белки муки.
В недавно проведенных работах протеолиз клейковины учитывали двумя методами: по изменению реологических свойств клейковины (с применением пластометра AB-1 и прибора УРК-1) и по растворимости белков в слабой уксусной кислоте. Кроме того, полученные растворы клейковины изучали методом гельфильтрации на Сефадекс Г-100. При автолизе как нормальной клейковины, так и клейковины проросшего или поврежденного клопом-черепашкой зерна наряду с увеличением ее растяжимости наблюдается значительное повышение растворимости ее белков в слабом растворе уксусной кислоты. У клейковины дефектного зерна после 24-часового автолиза переходит в уксуснокислый раствор около 98% всех белков, тогда как у клейковины нормального зерна растворяется только около 70% белка.
Из сопоставлений этих данных с приведенными выше следует, что изменение реологических свойств пшеничного теста и клейковины во времени обусловлено деятельностью протеаз зерна.
Сравнительное исследование растворов клейковины нормального и поврежденного зерна позволило обнаружить существенную разницу между ними. Дефектная, разжижающаяся клейковина в свежеотмытом состоянии обнаруживает большее количество высокомолекулярных фракций белка, чем нормальная. Однако после автолиза содержание этих фракций заметно снижается при соответствующем увеличении содержания фракций меньшей молекулярной массы. У клейковины нормального зерна несколько повышается содержание высокомолекулярной фракции при автолизе, но сумма высокомолекулярных фракций при этом не изменяется, т. е. деполимеризации белка не происходит.
Выделение из свежеотмытой и из автолизированной клейковины дефектного зерна ее глиадиновой фракции и хроматография его в тонком слое показала, что молекулярная масса глиадина при автолизе существенно не меняется. Отсюда можно сделать важный вывод, что разжижение клейковины при автолизе обусловлено деполимеризацией ее глютениновой фракции, но это заключение нуждается в дальнейшем экспериментальном подтверждении.
Высказываемые ранее в литературе предположения, что протеазы пшеницы представляют собой ферменты типа папаина, по-видимому, не находят своего подтверждения. По крайней мере, большая часть этих ферментов не нуждается в активировании восстановителями. Вместе с тем фракционированием на Сефадекс оказалось возможным разделить солевой экстракт пшеничной муки на две фракции протеаз, одна из которых — протеаза В активировалась восстановителями. Тем не менее эти вопросы необходимо изучать еще.
Большой интерес представляют данные о присутствии в зародыше пшеницы фермента глютатионредуктазы, восстанавливающей окисленный глютатион в присутствии НАДФ н НАДФН. Активность этого фермента сильно возрастает при прорастании зерна.
Вероятно, глютатионредуктаза оказывает воздействие не только на глютатион, но и на белки, восстанавливая дисульфидные связи с образованием низкомолекулярных продуктов, Возможность существования такого механизма воздействия показана в отношении протеиндисульфидредуктазы гороха, Этот фермент в присутствии восстановленного НАДФ и соответствующего белка восстанавливает дисульфидные связи последнего.
Сопоставляя данные изменения реологических свойств белков клейковины при разрыве межмолекулярных дисульфидных связей с быстрым изменением клейковины проросшего зерна, можно предполагать, что в этих случаях наблюдается один и тот же механизм деполимеризации макромолекулы клейковинных белков, в первую очередь глютенина. Продолжение исследований в этом направлении может выявить важные факты, касающиеся структуры белков зерна злаков.
Представляют интерес данные, характеризующие протеазу зерновки нормальной ржи, полученную путем экстрагирования водой и сорбции yа ДЭАЭ — Сефадекс А-50 и последующего фракционного осаждения сульфатом аммония. В качестве субстрата для этого фермента был использован синтетический полипептид N-α-бензоил-Д, L-аргинин-n-нитроанилид (БАПА). В процессе очистки оказалось возможным повысить его активность в 140 раз (табл. 128). В отличие от гидролизующего БАПА фермента ячменя, описанного ниже, он ингибировался диизопропилфторфосфатом (ДФФ), как и трипсин. Эти данные позволили высказать предположение, что фермент представляет собой сериновую гидролазу. Вопрос о характере воздействия его на белки ржи нуждается в дальнейшем изучении.
