Методы получения и изучения ферментов зерна

Наиболее часто применяют метод извлечения ферментов путем экстракции измельченного зерна водой или солевыми растворами.
Получаемые водные вытяжки содержат не только ферменты, но и белки, не обладающие ферментативной активностью. Поэтому дальнейшее изучение растворов, содержащих ферменты, проводится разными способами, в зависимости от поставленной задачи исследований.
Для получения концентрированных препаратов ферментов применяют фракционное осаждение раствора возрастающими концентрациями сернокислого аммония или осаждение ацетоном с последующим фракционированием полученного осадка. Эффективным способом получения ферментов, свободных от неактивного белка, является фракционирование растворов на геле Сефадекс или на полиакриламидном геле с определением активности фермента в каждой получаемой фракции. Препаративную хроматографию ферментных растворов на гелях в настоящее время широко применяют и при исследовании ферментов зерна. Наряду с этими методами разрабатывают также и некоторые специфические способы получения отдельных ферментов в наиболее концентрированном виде. Так, высокоактивные препараты α-амилазы получают путем адсорбции на гликогене, который является хорошим субстратом для фермента. Амилаза затем гидролизует его полностью, образовавшиеся сахара удаляются, остается высокоочищенная α-амилаза.
Для характеристики различных ферментов необходимо:
а) определить оптимальную концентрацию водородных ионов, при которой фермент наиболее активен. Для этого проводят опыты в среде различной величины pH и строят кривую изменения активности в зависимости от нее. Выявление кислотного оптимума фермента имеет огромное значение для технологии переработки зерна;
б) определить температурный оптимум действия фермента и выявить зону термической инактивации его. Значение этих данных для работы с зерном исключительно велико, и получение соответствующих материалов является обязательным при исследовании;
в) исследовать, является ли данный фермент однородным или же он состоит из нескольких изоэнзим, обладающих различной электрофоретической подвижностью, разными кислотными и температурными оптимумами и разной молекулярной массой. Для решения этого вопроса применяются методы электрофореза свободного, на бумаге или в геле крахмала или полиакриламида с последующим определением активности каждой полученной фракции;
г) выяснить наличие в зерне активаторов или ингибиторов данного фермента.
Эти вопросы имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Так, наличие природных ингибиторов протеолитических ферментов в зерне может обусловить устойчивость клейковинных белков пшеницы по отношению к ферментам клопа-черепашки, а ингибиторы липоксигеназы, находящиеся в зародыше зерна злаков, могут замедлить процессы окислительной порчи содержащегося в нем жира.
Следует подчеркнуть, что вопрос об активаторах и ингибиторах ферментов зерна разработан еще неудовлетворительно, и требуется проведение всесторонних исследований свойств и активности этих веществ.
На современном уровне знаний биохимии зерна уже нашли широкое применение методы, характеризующие некоторые ферменты. Эти методы очень важны для оценки качества зерна и продуктов его переработки. При использовании этих методов необходимо учитывать некоторые общеметодические обстоятельства и устанавливать основные принципы для разработки и применения их на практике. В частности, большое значение имеет вопрос, нужно ли использовать для определения активности различных ферментов их вытяжки, полученные экстракцией водой или солевым раствором, или же использовать суспензию измельченного зерна или муки. Это связано с тем, что в первом случае мы изучаем воздействие фермента на какой-то посторонний субстрат (например, клейстеризованный или нативный крахмал при исследовании α- или β-амилазы). Во втором случае исследуют воздействие фермента на его природный субстрат, например нативный крахмал пшеницы. Учитывая, что для практики важно, как будет вести себя в данном случае замешанная в тесто мука, в какой мере в этой среде будет проходить гидролиз крахмала под влиянием амилаз; второй путь кажется более целесообразным. Иначе говоря, для характеристики качества зерна или муки по активности ферментов, расщепляющих крахмал, следует применять автолитические методы.
Ho при этом следует непременно учитывать и температурный фактор. Так, осахаривание крахмала β-амилазой в тесте происходит при температуре 30° С, тогда как его деполимеризация α-амилазой происходит в момент выпечки при температуре, оптимальной для этого фермента, т. е. 50—65° С. Отсюда следует, что и методика определения α-амилазы муки должна предусматривать создание оптимальных температурных условий для фермента. В последующем изложении будет показано, как внимательно следует подходить к выбору методики определения активности ферментов зерна для того, чтобы получить данные, на основании которых можно прогнозировать качество пшеничной или ржаной муки.
В этом аспекте особое внимание следует обратить на методику, применяемую для определения активности протеаз. Большое значение здесь имеет субстрат, на который воздействует фермент. В настоящее время большинство исследователей при характеристике протеаз зерна применяют в качестве субстрата белки животного происхождения гемоглобин или казеин и его производные или же синтетические субстраты в виде полипептидов. Таким образом, получают данные, характеризующие активность протеаз по отношению не к белкам зерна, а к постороннему субстрату. Методологически неправильный подход такого рода приводит к получению неверной характеристики активности фермента. Например, экспериментально было показано, что гемоглобин легче поддается воздействию протеаз зерна, чем собственные белки последнего. Иначе говоря, данные об активности протеаз, полученные по гемоглобину, не могут быть прямо перенесены на белки муки. Только в последнее время начали применять автолитический метод определения активности протеаз муки и воздействие последних на клейковинные белки.
Эти соображения необходимо учитывать при изучении ферментов зерна для характеристики технологических достоинств продуктов его переработки.
Из всего количества ферментов, обнаруженных в зерне злаков, обстоятельному изучению подверглась лишь незначительная часть. Наибольшее внимание было обращено на те ферменты, которые оказывают или могут оказать прямое воздействие на качество продуктов переработки зерна. К этим ферментам относятся амилазы, протеазы, липазы, липоксигеназы и полифенолоксидазы. Наряду с этим исследованиями было установлено, что некоторые ферменты зерна могут явиться хорошими индикаторами его физиологического состояния. Так, каталаза, являясь очень термолабильной, хорошо отражает понижение всхожести при сушке семенного зерна, и ее активность может служить для контроля процесса сушки. Очень чувствительным индикатором изменения всхожести риса при его сушке или хранении является декарбоксилаза глютаминовой кислоты, а также некоторые другие ферменты, изучение которых продолжается.
Ho отсюда не следует, что еще неизученные ферменты зерна злаков не влияют на качество продукции или не являются индикаторами биологического состояния зерна. Надо отметить также отсутствие исследований по взаимосвязи различных ферментов зерна друг с другом. В этом отношении имеются только отдельные наблюдения, еще недостаточные, но при изучении их могут быть получены важные данные.
Так, например, показано, что переход амилазы зерна из латентного в активное состояние осуществляется в результате воздействия протеаз на комплекс фермент — белок, не обнаруживающий активности.
Несомненная связь может существовать между активностью липаз и протеаз: продукты окисления липидов могут воздействовать на свойства клейковинных белков и, вероятно, непосредственно инактивировать протеазы. Результатом воздействия может быть значительное укрепление клейковины, улучшение реологических свойств пшеничного теста. Исследование этих сложнейших взаимодействий ферментов зерна и изменений субстратов, на которые они влияют, может дать важные данные о факторах, регулирующих свойства зерна как сырья для выработки муки и крупы высокого качества.