Методы исследования липидов
Общие методы исследования липидов растительного сырья, а также специальные способы изучения отдельных фракций липидов изложены в ряде руководств (Руководство по методам исследования, техно-химическому контролю и учету производства в масложировой промышленности, разработанное ВНИИЖ, т. I—IV, 1967—1969; Методы анализа жиров Американского общества жировых химиков, 1968, и др.).
При изучении липидов пшеницы и других злаков и их значения для технологических процессов переработки зерна необходимо выбирать такие методы, применение которых не будет препятствовать дальнейшему изучению компонентов, оставшихся после экстракции жиров, т. е. не вызовет необратимых изменений белковых веществ.
Это обстоятельство часто не учитывают при изучении липидов муки хлебопекарного назначения, что может привести к неправильным выводам. Так, наиболее широко применяемым неполярным растворителем является диэтиловый эфир, в отношении которого предполагали, что он инертен для белков.
Недавно были проведены специальные опыты, показавшие, что обработка пшеничной муки этим растворителем приводит в некоторых случаях к значительному укреплению клейковины. Последняя после экстракции диэтиловым эфиром может перейти из группы слабая в группу средняя или даже в группу сильная. Это объясняется тем, что при хранении эфира в лабораторных условиях происходит его автооксидация, и в нем накапливается перекись этила C2H5—О—О—C2H5. Это вещество представляет собой маслянистую жидкость, плохо растворимую в воде и, как и другие перекисные соединения, значительно укрепляющую клейковину.
Во избежание этого побочного влияния, которое может совершенно исказить результаты исследований, необходимо для экстракции липидов из муки или для добавления в нее различных растворимых в эфире веществ применять только свежеперегнанный диэтиловый эфир. Другие растворители, как неполярные, так и полярные, тоже не являются инертными по отношению к белкам клейковины. Так, недавно было показано, что клейковину укрепляют некоторые углеводороды, хлороформ и н-гексанол (рис. 58).
Из полярных растворителей особенно сильное воздействие на свойства клейковины оказывает н-бутанол как безводный, так и насыщенный водой. Обработка муки им снижает во много раз растяжимость клейковины и соответственно увеличивает продолжительность выпрессовывания ее из пластометра.
Следует отметить, что именно насыщенный водой н-бутанол чаще всего применяют для экстракции липидов пшеничной муки и нужно учитывать его влияние на белки клейковины. При необходимости последующего изучения белков муки использование этого растворителя недопустимо.
Общее количество и состав липидов, извлекаемых из зерновки злаков, колеблются в значительных пределах, в зависимости от вида растворителя. Неполярные жидкости — диэтиловый эфир, ацетон, петролейный эфир, бензин, хлороформ — извлекают только около 50—70% всех липидов. Эта фракция обозначается как свободные липиды и состоит главным образом из три-, ди- и моноглицеридов и свободных жирных кислот. Оставшиеся после экстракции так называемые связанные липиды можно извлечь, применяя такие растворители, как этанол, смесь этанола с метанолом, насыщенный водой н-бутанол. Последний экстрагирует из зерна и муки наибольшее количество липидов, разрушая липопротеиновые комплексы.
Хорошим растворителем связанных липидов является реактив Фолча, т. е. смесь хлороформа с метанолом в отношении 2:1. Эту смесь часто применяют и для извлечения суммы липидов. Особое значение имеет то обстоятельство, что метанол практически не влияет на свойства клейковины.
Изменение количества экстрагируемых липидов и соотношения их отдельных фракций в зависимости от растворителя показано в таблице 77. Для экстрагирования суммы липидов муки предложена смесь хлороформа, этанола и воды в соотношении 40:19:1. Этот растворитель извлекает столько же липидов, сколько и насыщенный водой н-бутанол, но менее агрессивен по отношению к белкам, чем последний (табл. 78).
Однако перечисленные растворители удаляют липиды не полностью, часть их все же остается в муке и освобождается только после полного кислотного гидролиза всех ее компонентов. По предложенной ВНИИЖ терминологии эта фракция называется фракцией прочно связанных липидов. Для ее извлечения необходимо подвергать исследуемый материал кислотному гидролизу.
Для специальных целей исследования роли липидов в определении качества клейковины был предложен ферментативный метод извлечения прочносвязанных липидов, о котором говорилось ранее.
Существенное значение для количества извлекаемых липидов имеет температура, при которой проводят их экстракцию. С повышением последней, как правило, растворимость липидов повышается (табл. 79). Однако известно, что повышение температуры может повлечь за собой ускорение всех процессов изменения нативных липидов, их гидролиза или окисления. Поэтому при исследовании структуры отдельных компонентов липидных фракций нежелательно повышать температуру растворителя. В этих случаях экстракцию ведут на холоду (t = 5—20° С) и в бескислородной среде во избежание окисления. Заслуживает внимания также предложенная методика предотвращения окислительных изменений липидов при их экстракции, заключающаяся в добавлении к растворителю 4-метил-2,6-дитретичиого бутилфенола в качестве антиоксиданта. Было доказано, что он препятствует окислению липидов в процессе их извлечения и в то же время может быть легко удален из экстрагированной смеси.
Прогресс в технике исследования липидов за последнее время обусловил возможность применения микрометодов для изучения их. Была разработана методика экстракции и исследования липидов одной зерновки пшеницы (массой около 30 мг) и даже ее половинки. Заслуживает внимания также комбинированный метод исследования липидов пшеницы, позволяющий экстрагировать 3—6 мг материала в специальном экстракторе (рис. 59) и проводить разделение фракций тонкослойной хроматографией. Полученные на хроматографической пластинке фракции затем подвергаются гидролизу, метилируются и полученные метиловые эфиры жирных кислот исследуются методом газо-жидкостной хроматографии. Применение этого микрометода может быть рекомендовано только для однородного материала, например для муки высшего и первого сортов. В противном случае в микронавеску могут попасть сильно различающиеся по содержанию и свойствам липидов частицы зерновки, и получаемые результаты не будут характеризовать весь материал в целом.
При экстрагировании муки полярными растворителями в вытяжку, кроме липидов, переходят и другие вещества, например сахара, от которых необходимо избавиться для дальнейшего исследования собственно липидов.
Получаемые при помощи различных растворителей фракции как свободных, так и связанных липидов не однородны. Ниже представлена схема соотношения основных компонентов липидов, извлекаемых из пшеничной муки.
Разделение и идентификация этих соединений может быть осуществлена различными методами, из которых наиболее широкое применение нашли хроматография на колонках силикагеля и хроматография в тонком слое. Ниже представлена схема получения суммы липидов пшеничной муки последовательным извлечением различными растворителями.
Принципиальная схема разделения липидов на колонке силикагеля предложена Акером в 1974 г.
Модификация метода извлечения и предварительного разделения липидов пшеничной муки, при помощи которой было идентифицировано наибольшее количество компонентов липидных фракций, представлена на схеме далее. Дальнейшее разделение и идентификация отдельных классов липидов может быть осуществлена методом хроматографии в тонком слое силикагеля или на аминоэтилированной бумаге.
Существенное значение для характеристики собственно липидов имеет определение их жирнокислотного состава, особенно содержания непредельных жирных кислот. Именно от присутствия в молекуле жира того или иного количества двойных связей в значительной степени будет зависеть устойчивость продуктов переработки зерна при хранении, их способность к прогорканию. Кроме того, свободные непредельные жирные кислоты оказывают специфическое воздействие на свойства клейковины пшеницы. Для общей характеристики липидов определяют йодное число, характеризующее суммарное содержание двойных связей в молекуле, родановое число, число омыления, т. е. среднюю молекулярную массу жирных кислот, входящих в состав липида, и кислотное число. Последнее имеет особое значение при исследовании зерна и продуктов его переработки, так как гидролиз жира, происходящий при неблагоприятных условиях хранения, обусловливает быстрое повышение кислотного числа, что отражает в определенной степени порчу продукта.
Классическим методом точной идентификации и количественного определения жирных кислот, входящих в состав липидов, является выделение их путем гидролиза, последующее метилирование и разделение полученных метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии.
При экстрагировании липидов извлекают также некоторое количество сопутствующих им веществ, в которых не обнаружено сложноэфирных связей. При омылении жира для определения его жирнокислотиого состава эти вещества находятся в так называемой неомыляемой фракции. В ней можно идентифицировать разнообразные классы органических соединений: алифатические углеводороды с разветвленной или неразветвленной углеродной цепью, алифатические спирты, циклические спирты и гетероциклы. Некоторые из этих веществ обладают характерной окраской (каротиноидные пигменты, хлорофилл), другие отличаются высокой биологической активностью (токоферолы, стерины). В связи с этим при изучении липидной фракции зерна злаков необходимо обращать внимание и на неомыляемый остаток, определяя его компоненты специальными методами, описанными в литературе.