Проламин и глютелин кукурузы

28.10.2014

Литературные данные о содержании проламина в зерновке кукурузы очень противоречивы. Так, в сводке по биохимии культурных растений указывается, что количество проламина кукурузы — зерна может колебаться в пределах от 4 до 60% всего белка зерновки. По-видимому, основной причиной таких расхождений являются различные условия извлечения белка.
Первостепенное значение при этом имеет концентрация этанола, применяемого для растворения проламина, и температура экстракции. На рисунке 17 представлено влияние этих факторов на растворимость зерна. Максимальное количество зерна переходит в раствор при температуре 60°С и концентрации этанола в пределах от 55 до 60%. Однако и при этих условиях растворяется только около 80% всего проламина; для извлечения остального белка необходимо применить этанол 85—96%-ной концентрации. Растворимый в нем зеин обозначают как α-зеин в отличие от β-зеина, растворимого в этаноле меньшей концентрации. По данным некоторых авторов, преобладающим компонентом является α-зеин, что противоречит другим данным о том, что фракция α-зеина составляет только около 15—20% всего белка.
Растворы зеина в концентрированном спирте весьма нестойки и вскоре образуют своеобразный студень, природа которого еще совершенно не изучена. Установлено, что процесс студнеобразования необратим.

Следует отметить, что аналогичный студень образуется и в растворах проламинов других зерновых культур, относящихся к трибе сорговых.
Извлеченный 60—70%-ным раствором этанола зеин при электрофорезе в крахмальном геле обнаруживает значительную неоднородность.
Так как молекулярная масса части белка большая, этот белок остается на старте. Если суммарный белок, извлеченный 60—70%-ным раствором этанола разделить на две фракции (растворимый в 95%-ном растворе этанола α-зеин и нерастворимый в нем β-зеин), то при электрофорезе первая фракция имеет такую же подвижность, как фракция исходного зеина. В отличие от этого β-зеин не мигрирует в гель; иначе говоря, он представляет собой неподвижную фракцию исходного зеина.

Обработка β-зеина или исходного зеина восстановителями снижает молекулярную массу белка, и он мигрирует в гель. Этот факт свидетельствует о том, что дисульфидные связи зеина являются межмолекулярными в отличие от глиадина пшеницы, в котором они внутримолекулярны.
Молекулярную массу зеииа и его фракций определяли неоднократно различными методами. Ультрацентрифугированнем исходного, т. е. неразделенного на α- и β-фракции зеина, получили величину молекулярной массы в среднем 44 000. Восстановленный и алкилированный зеин при тех же условиях давал молекулярную массу около 19 000, что соответствует данным других авторов, полученным при определении С-концевых аминокислот.
Гельфильтрация растворимого в 60%-ном растворе этанола зеина на колонке Сефадекс Г-200 позволила получить четыре фракции белка: А, В, С и Д. Фракция С оказалась гетерогенной, гельфильтрацией на Сефадекс Г-100 она разделялась на два компонента: Cа и Cв.
Определение молекулярной массы этих белков путем сопоставления с данными гельфильтрации белков известной молекулярной массы показало, что наибольшую массу, равную 190 000, имела фракция Cа, а наименьшую (52 000) — фракция Cn (рис. 18). В отличие от данных других авторов в цитированной работе восстановление белков для разрыва дисульфидных связей не дало никаких результатов как при электрофорезе, так и при гельфильтрации. Скорее всего, приводимые величины молекулярной массы зеина относятся к ассоциированным молекулам этого белка.
Аминокислотный состав зеина в сопоставлении с глиадином пшеницы и гордеином ячменя представлен в таблице 22. Характерным отличием зеина является отсутствие в его молекуле аминокислот триптофана и лизина, что отрицательно сказывается на биологической ценности этого белка. Исходя из удельного объема молекулы и молекулярной массы, равной 35 000, были рассчитаны размеры молекулы зеина: длина 322 А, ширина 16 А (рис. 19).
Изучение глютелиновой фракции кукурузы затруднено вследствие слабой растворимости ее в обычных растворителях. Применение 0,2%-ного раствора едкого натра, как это предусмотрено классической схемой Осборна, приводит к значительным изменениям белка; в частности, к разрыву дисульфидных связей.

Некоторые исследователи изучали различные методы извлечения глютелинов кукурузы после предварительного удаления водо-, соле- и спирторастворимых белков. При этом глютелин характеризуют как белок, который не переходит в раствор после повторной экстракции альбуминов, глобулинов и проламинов. Для удаления проламинов применяли этанол 70%-ной концентрации, что не обеспечивает полноту извлечения зеина. Таким образом, можно предполагать, что препараты глютелинов кукурузы содержат также и некоторое количество зеина.
В работах, сопоставлявших свойства белков нормальной и высоколизиновой кукурузы, исходный материал обрабатывали щелочным раствором сульфита и окиси меди для расщепления дисульфидных связей и экстрагирования всех белковых веществ. Полученный раствор фракционировали на водо-, соле- и спирторастворимые белки и глютелин. При электрофорезе последний обнаружил один пик (в буфере при pH 11,2), а при ультрацентрифугировании дал три компонента; один из них обладал наименьшей молекулярной массой, равной 21 000—26000. По-видимому, он и представлял собой основную субъединицу глютелина.
Экстрагированный 0,1 M раствором едкого натра и восстановленный меркаптэтанолом (с последующим алкилированием тиоловых групп) глютелин при электрофорезе в крахмальном геле давал шесть полос, но незначительная его часть оставалась на старте. Некоторые из мигрирующих в гель компонентов имели подвижность, близкую к подвижности восстановленного зеина и глобулинов.
В последующих исследованиях сопоставляли свойства препаратов глютелинов кукурузы, полученные различными методами: экстрагированием 0,1M раствором едкого натра; 8М раствором мочевины+0,075М раствором меркаптэтанола; 0,2М раствором диметиламиноэтанола; раствором хлорэтанола +0,01М раствором соляной кислоты. Кроме того, применяли способ получения глютелина при удалении крахмала из материала, экстрагированного по схеме Осборна (т. е. после обработки водой, солевым раствором и 70%-ным раствором этанола α-амилазой. Наибольшее количество белка экстрагирует 0,1M раствор едкого натра и наименьшее 8М мочевина с меркаптэтанолом (86 и 16% всего находящегося в материале белка соответственно). Обработанный α-амилазой остаток составлял 74% всего находившегося в материале белка; иначе говоря, ферментативная обработка повлекла за собой некоторую потерю белка, возможно вследствие присутствия в препаратах протеолитических ферментов. Близкий к этому количеству выход белка был получен также при удалении крахмала из остатка при растворении его в 90%-ном растворе диметилсульфоксида. Аминокислотный состав полученных препаратов различен (табл. 23).

Прежде всего глютелин, полученный извлечением 0,1М раствором едкого натра, содержит цистина вдвое меньше, чем выделенный обработкой α-амилазой. Это подтверждают данные других авторов. Отмечается также и некоторое снижение содержания лизина, вероятно, вследствие взаимодействия его с продуктами расщепления цистина. Следует отметить, что ни один из полученных препаратов не содержал сульфгидрильных групп, т. е. в нем отсутствовал цистин, что было показано методом амперометрического титрования.
Найденные существенные различия в содержании других аминокислот показывают, что препараты глютелина, полученные перечисленными методами, неоднородны по своему белковому составу.
При свободном электрофорезе глютелин, экстрагированный 0,1M раствором едкого патра при температуре +1°C, дает электрофореграммы с широким распределением компонентов и двумя пиками при подвижности в две и пять единиц Тизелиуса (рис. 20). При электрофорезе в крахмальном геле большая часть его остается на старте. Глютелин, извлеченный тем же раствором, но при более высокой температуре (+25°С), дает комплексную электрофореграмму при свободном электрофорезе и ряд полос при электрофорезе в крахмальном геле. Вероятно, при указанной температуре происходит не только разрыв дисульфидных связей, но и другие деструктивные изменения молекулы белка. Глютелин, полученный обработкой α-амилазой, нерастворим в растворах, применяемых для электрофореза, и его предварительно восстанавливали и алкилировали. В этом случае при свободном электрофорезе обнаружилось широкое распределение компонентов, а при гель-электрофорезе — несколько полос, соответствующих субъединицам глютелина и почти тождественных препаратам, полученным при удалении крахмала растворением в диметилсульфоксиде.

Изложенные материалы позволяют сделать вывод, что глютелин кукурузы может переходить в раствор только при разрушении его дисульфидных связей.
Так же как и высокое содержание цистина, этот факт подтверждает, что в эндосперме кукурузы глютелин находится в виде трехмерной сетки с поперечными дисульфидными связями. При восстановлении этих связей образуются субъединицы белка, подвижность которых при электрофорезе находится между подвижностью альбумина, глобулина и зеина. Что касается электрофоретических компонентов глютелина, полученного извлечением 0,1 M раствором щелочи, то они являются продуктами деградации белка.