Белки (альбумины и глобулины), растворимые в воде и солевых растворах

28.10.2014

Исследования, проведенные с использованием новых методов, показали необходимость внесения поправок в схему классификации белков, предложенную Осборном. Если применить повторное экстрагирование пшеничной муки водой и подвергнуть полученные растворы электрофорезу в крахмальном геле при определенных условиях (лактат-алюминиевый буфер pH 3,1, ионная сила 0,06, сила тока 30 mА, электрофорез продолжительностью 80-160 мин при температуре 3°С), можно будет идентифицировать в водных растворах не только альбумины, но и глобулины и глиадин. Очевидно, переход в раствор глобулинов объясняется тем, что при экстракции в воду переходят также соли, находящиеся в зерне (главным образом, фосфаты), как это было показано в более ранних исследованиях растворимости белков зерна. Глиадин переходит в раствор по мере повторной экстракции; после первой экстракции водой в растворе обнаруживаются четко только альбумины и глобулины, во втором и третьем экстракте появляется уже глиадин, количество которого достигает максимума в четвертом экстракте.
Частичное растворение глиадина в воде, возможно, объясняется тем, что гидролиз органических соединений фосфора приводит к образованию кислых продуктов, которые повышают концентрацию водородных ионов H+ раствора, в результате чего глиадин начинает растворяться.
На основании приведенных данных было предложено характеризовать фракции растворенных белков по относительной скорости их передвижения на электрофореграмме вместо абсолютной величины их электрофоретической подвижности, которая сильно колеблется в зависимости от многих факторов. Поэтому положение самого быстрого компонента электрофореграммы обозначается как «100», место старта как «0», а промежуточные точки соответственно их положению на электрофореграмме.
На рисунке 8 приведены денситограммы электрофореза водных вытяжек пшеничной муки первой экстракции (справа), содержащей только альбумины и глобулины, и третьей экстракции (слева), в которой присутствует также и медленно передвигающийся глиадин.
Глиадин можно рассматривать как белок, переходящий в водный, водно-спиртовой или водно-солевой раствор, обнаруживаемый на электрофореграмме как медленно движущийся компонент (относительная скорость передвижения Rf=31), в отличие от быстро движущихся альбуминов и глобулинов. При данных условиях глютенин остается на старте, так как он имеет большую молекулярную массу.
Результаты исследования показали, что между водными и водно-солевыми вытяжками пшеничной муки при их электрофорезе в крахмальном геле принципиальных различий не отмечается. Следовательно, в эти растворы переходят как альбумины, так и глобулины.
Таким образом, различие этих групп белков по растворимости носит скорее количественный, нежели качественный характер.

Белки (альбумины и глобулины), растворимые в воде и солевых растворах

Приведенные материалы подтверждают уже высказанные мнения об известной условности разделения белков только по их растворимости.
Изучение белковых фракций пшеничной муки, растворимых в воде и солевых растворах, позволило полнее изучить свойства этих белков.
Методом диализа их водно-солевых растворов и последующего переосаждения оказалось возможным выделить несколько фракций, различных по растворимости. Альбумины почти полностью растворялись в воде (табл. 11), и почти также хорошо в растворе 0,5М хлористого натрия (98 и 99% соответственно переходило в раствор). Эта фракция, следовательно, полностью соответствует характеристике альбуминов, дайной Осборном.
Белки (альбумины и глобулины), растворимые в воде и солевых растворах

Глобулины практически не растворялись в воде (в раствор перешло 3—6%), однако они не полностью переходили в солевой раствор; скорее всего произошла денатурация белков, Альбуминовая фракция при электрофорезе в трис-буфере pH 8,9 давала 21 четко выраженную полосу, в алюминиево-лактатном буфере (pH3,1) — только 12 полос (рис. 9). Препаративным электрофорезом и гельфильтрацией на Сефадекс Г-50 и ДЭАЭ-целлюлозе из водорастворимой фракции удалось выделить два белковых препарата альбумина: 13-А и 13-Б, однородных по своим электрофоретическим свойствам и гельфильтрации (рис. 10). Молекулярная масса их была определена тремя методами: ультрацентрифугированием, гельфильтрацией и по аминокислотному составу. Все три метода дали близкие результаты (табл. 12). Спектры флуоресценции были типичными для белков, содержащих триптофан, а измерение циркулярного дихроизма показало, что альбумин 13-А содержит от 20 до 40% структуры α-геликс, a альбумин 13-Б — около 40%.
Белки (альбумины и глобулины), растворимые в воде и солевых растворах
Белки (альбумины и глобулины), растворимые в воде и солевых растворах

На рисунке 11 представлена калибровочная кривая для колонки Сефадекс Г-100 при гельфильтрации белков известной молекулярной массы и альбуминов 13-А и 13-Б.
Дальнейшие исследования показали, что оба альбумина находятся только в зерне пшеницы мягкой и отсутствуют в зерне пшеницы твердой.
Из зерна мягкой пшеницы сорта Капелль-Депреш был выделен альбумин, состоящий из одного полипептида и по своему аминокислотному составу близкий к альбумину 13-Б. Определение его молекулярной массы методом ультрацентрифугирования дало величину около 26000, т. е. вдвое большую, чем указывалось выше. Ho, по-видимому, в данном случае произошла ассоциация молекул белка, так как определение его молекулярной массы электрофорезом в присутствии додецил-сульфата натрия привело к получению величины молекулярной массы, равной 13 200.
Белки (альбумины и глобулины), растворимые в воде и солевых растворах

Исследование 52 образцов сортов мягкой пшеницы и образцов твердой пшеницы подтвердило наличие в первой специфического альбумина, который был выделен гельфильтрацией на ДЭАЭ-целлюлезе (трис-буфер pH 9,5). Ультрацентрифугированием была доказана его гомогенность и определена молекулярная масса, равная 23 000. Молекулярная масса, рассчитанная по аминокислотному составу, составила около 20 000. Значения полученных результатов близки друг к другу. По электрофоретической подвижности этот белок обозначен как Мв-0,19.
Наличие специфических для обыкновенной (мягкой) пшеницы растворимых в воде белков было доказано также методами иммунохимии, о чем более подробно будет сказано ниже.
При общем незначительном содержании альбуминов и глобулинов в зерновке пшеницы наиболее богат ими зародыш, из которого водой и солевыми растворами можно экстрагировать около 20% белка. Около 85% его составляет альбуминовая фракция.
Электрофорез очищенных препаратов альбуминов зародышей и эндосперма пшеницы позволил установить наличие у них 8—11 компонентов. В белках эндосперма обнаружено четыре компонента щелочного характера, остальные компоненты кислые. В белках зародыша содержится восемь-девять кислых фракций и две щелочных, Ho в целом между электрофореграммами альбуминов эндосперма и зародыша обнаруживается лишь незначительное сходство.
Применяя метод Гесса, т. е. фракционирование в неполярных жидкостях, из тонкоизмельченных отрубей оказалось возможным извлечь содержимое клеток алейронового слоя в виде тонких пластинок размером 1—3 мкм и содержащих 30—35% белка. Этот белок на 50% состоит из водорастворимой фракции, которая по своему аминокислотному составу почти идентична нерастворимой в воде фракции. Из сопоставления аминокислотного состава белка алейронового слоя с белками эндосперма видно, что они резко различаются (табл. 13). Растворимый белок частично ассоциирован с углеводами, в состав которых входят глюкоза, манноза и галактоза.
Белки (альбумины и глобулины), растворимые в воде и солевых растворах

Содержимое алейроновых клеток богато минеральными веществами, особенно фосфором, большая часть которого связана с нерастворимой в воде белковой фракцией.
Альбумины, извлекаемые из зародыша, обладают высокой активностью ферментов, состав и свойства которых будут рассмотрены позднее.
Растворимые в воде и солевых растворах белки пшеницы и других злаков, образующие комплексы с углеводами (глико-протеины), изучены еще недостаточно. В ряде случаев даже очищенные методом препаративного электрофореза альбумины содержат 9—10% углеводов в виде полисахаридов, в молекулу которых входят глюкоза, ксилоза и арабиноза.
При изучении фракции растворимых пентозанов пшеничной муки было показано, что она представляет собой гликопротеин, в котором белок прочно связан с остатками βD-ксилопиранозы и αl-арабофуранозы.
Как показали исследования хвостовой фракции пшеничной муки, гликопротеиновые комплексы могут образовываться также и с нерастворимыми пентозанами. Фракция представляет собой верхний слой осадка, полученного при центрифугировании суспензии пшеничной муки, из которой была удалена клейковина при промывании теста водой. Нижний слой осадка состоит из зерен крахмала, обладающих наибольшей плотностью, а верхний — из небольшого количества частиц оболочек зерновки и слизистых веществ. Этот последний слой при повторном центрифугировании можно разделить на крахмалистую часть, состоящую на 90% из крахмальных зерен и собственно фракцию слизей. Последняя содержит около 16% белка, прочно связанного с пентозанами и нерастворимого в воде. Обработка слизей протеолитическими ферментами значительно снижает содержание в них белка, но тем не менее часть белка не поддается воздействию ферментов. Скорее всего белок соединен ковалентными связями с высокомолекулярными полисахаридами, что обусловливает его нерастворимость в воде. Электрофорез в крахмальном геле (в алюминиево-лактатном буфере pH 3,1) обнаруживает его сходство с альбумином пшеницы.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: