Белковые вещества клейковины

24.10.2014

Зерно пшеницы содержит белковые вещества, которые можно разделить на четыре группы: растворимые в воде альбумины, растворимые в солевых растворах глобулины, растворимый только в спирте определенной концентрации глиадин и не растворимый в спирте, в воде и солевых растворах, но растворимый в щелочах глютенин. Последние два не растворимые в воде белковых вещества называются также клейковинными, так как они являются основными компонентами отмываемой из пшеничного теста клейковины.
Значительное количество исследований было посвящено изучению количественных соотношений между этими группами белков в пшеничной муке различных сортов и в подобных продуктах помола. Эти исследования, обстоятельный обзор которых был сделан недавно, позволили установить определенную закономерность в содержании различных но растворимости белков в частицах оболочки, зародыше и эндосперме пшеницы. Именно в последнем и сосредоточены клейковинные белки, тогда как растворимые белки находятся в основном в алейроновом слое и зародыше. Отсюда следует, что в муке, содержащей много этих частиц, т. е. в муке высоких выходов, доля альбуминовой и глобулиновой фракции будет значительно выше, чем в муке высшего и I сорта.
Отсутствие в литературе систематических данных, характеризующих соотношение различных белковых фракций в пшеничной и ржаной муке разных сортов, не дает возможности проанализировать значение этого показателя для величины выхода сырой клейковины, получаемой при отмывании, и оценки роли клейковинных и неклейковинных белков в процессе выработки хлеба. Успехи современной протеинологии позволили получить более полное представление о белковых веществах пшеницы и ржи. Выделение этих веществ в нативном состоянии сильно затруднено вследствие их большой лабильности и способности вступать в реакции с различными другими соединениями — с липидами и особенно углеводами, поэтому получаемые характеристики отдельных белков пшеницы и ржи всегда будут в известной степени условны и будут колебаться в определенных пределах в зависимости от способов получения изучаемых препаратов.
Основной предпосылкой для исследования белков клейковины, имеющих исключительно большое технологическое значение, является выделение их в таком состоянии, которое позволяет вновь регенерировать из них клейковину. Только в этом случае можно считать, что в процессе извлечения и фракционирования молекулы белков не претерпели глубоких изменений и результаты исследований могут быть использованы при определении свойств этих белков в тесте в процессе его приготовления.
Большое значение поэтому имеет метод фракционирования клейковинных белков, разработанный достаточно давно и внесший существенные поправки в классический метод Осборна. Если для фракционирования глиадина последний может быть принят безоговорочно, так как растворение его в 70%-ном этиловом или метиловом спиртах не изменяет его нативных свойств, то при выделении глютеиина применение в качестве растворителя даже слабых растворов щелочи противопоказано. Использование слабых растворов органических кислот, в частности уксусной (0,01 н.), позволяет получить препарат глютенина, содержащий 17,1% азота и лишенный посторонних примесей. При этом нативные свойства глютенина не изменяются, при смешивании его с препаратом глиадина и добавлении воды получается клейковина, по всем своим свойствам тождественная нормальной, свежеотмытой из теста. Следует отметить, что сохранение характерных реологических свойств клейковины после ее растворения в слабой органической кислоте и осаждения из раствора тем или иным способом нашло самое широкое применение не только в протеинологии, но и в технике. Для получения препарата сухой клейковины используется ее свойство растворяться в кислоте, затем растворенную клейковину сушат в сублимационной или распылительной сушилке. Выделенные препараты глиадина и глютенина, представляющие в обезвоженном состоянии тонкие порошки, при добавлении к ним воды быстро поглощают ее, превращаясь в гидратированный студень, весьма различный по своим свойствам.

Белковые вещества клейковины

Глиадин при набухании в воде образует клейкую массу, совершенно лишенную упругости и внешне похожую на разжижившуюся клейковину зерна, поврежденного клопом-черепашкой. Гидратированный глютенин обладает упругостью, но совершенно лишен способности растягиваться, образуя эластичные тяжи, как это свойственно клейковине. При смешивании препаратов сухих белков и последующем добавлении воды, однако, образуется типичная клейковина.
В табл. 13 представлены количественные соотношения аминокислот, образующих полипептидные цепи первичной структуры — глиадина, глютенина, а также альбуминов и глобулинов пшеницы.
Как видно, глиадин и глютенин характеризуются высоким содержанием амидов дикарбоновых кислот — глютаминовой и аспарагиновой, а также аминокислоты пролина. Вместе с тем серусодержащих аминокислот цистина и цистеина в них значительно меньше, чем в белках неклейковинной фракций. Соотношение различных функциональных групп в белковых веществах пшеничной муки, представленное в этой же таблице, показывает существенные различия между клейковинными и растворимыми в воде и солях белками по содержанию амидных и серусодержащих групп. На рис. 3 представлена схема части пептидной цепи клейковинных белков с соответствующими функциональными группами и их возможное значение при образовании макромолекулы белка различной структуры.
Белковые вещества клейковины

Первостепенное значение имеют при этом ковалентные характеризующиеся высокой энергией связи (табл. 14). К этим связям относятся прежде всего пептидные связи, образующиеся при соединении двух α-аминокислот друг с другом. Эти связи могут быть разрушены только при энергичном воздействии на полипептидную цепочку, например при кипячении в концентрированной серной или соляной кислоте в течение длительного времени; в этих условиях осуществляется полный гидролиз пептидных связей и выделение аминокислот в свободном виде. Аналогичный гидролиз может происходить в более мягких условиях под влиянием соответствующих протеолитических ферментов.
Белковые вещества клейковины

Ковалентными являются также дисульфидные связи, возникающие при окислении сульфгидрильных групп двух молекул аминокислоты цистеина в цистин. Если произошло соединение цистеина боковых цепей полипептида, то образуется внутримолекулярная дисульфидная связь (рис. 4). Ho могут образоваться и межмолекулярные дисульфидные связи, соединяющие две отдельные полипептидные цепочки поперечными дисульфидными мостиками в единое целое; в этом случае происходит образование молекулы вдвое большего молекулярного веса по сравнению с исходными молекулами до соединения их между собой дисульфидными мостиками. При образовании внутримолекулярных дисульфидных связей масса молекулы не изменяется.
Ковалентные дисульфидные связи, обладая определенной прочностью, способны легко расщепляться под воздействием различных восстановителей, например этилмеркаптана, бисульфита. В зависимости от того, являются ли они в данном случае внутримолекулярными или межмолекулярными, при восстановлении белка его молекулярная масса или остается без изменения или же сильно снижается. Это обстоятельство имеет существенное значение для понимания структуры макромолекулы белковых веществ клейковины.
Большое значение для свойств белка имеют водородные связи, обладающие меньшей энергией и вследствие этого более легко разрывающиеся. Эти связи образуются как между CO — NH-гpyппaми полипептидных цепей, придавая им спиральную структуру (вторичная структура) (рис. 5), так и между амидными группами амидов дикарбоновых кислот боковых цепей полипептидов. За счет водородных связей между этими последними может происходить ассоциация молекул белка с образованием крупных агрегатов. В образовании сложной пространственной третичной структуры белка, кроме водородных связей, принимают участие также ван-дер-ваальсовы силы между боковыми радикалами полипептидных цепей, а также эфирные связи.
Белковые вещества клейковины

Существенное значение имеет то обстоятельство, что ослабление водородных связей применением специфических реагентов (мочевины, например) приводит к резкому изменению реологических свойств клейковинных белков, о чем более подробно будет сказано ниже.
Наконец, возможна ассоциация двух или нескольких глобул белка с образованием составной глобулы — четвертичная структура, которая может диссоциировать обратно на составные части.
Все большое разнообразие химических и физико-химических свойств белков обусловлено различиями в первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуре их молекул. Изучение этих структур поэтому необходимо для объяснения сложных взаимосвязей, имеющих место в технологическом процессе выработки хлеба.
Применение специальных методов исследования, разработанных в последнее время, позволяет получить важные данные об особенностях белковых веществ клейковины и их изменениях при выработке хлеба. Описания этих методов приводятся в соответствующей литературе.
При помощи этих методов были получены следующие сведения о глиадине, глютенине и в меньшей степени о альбуминах и глобулинах пшеничной муки:
1) аминокислотный состав белка, в том числе содержание серусодержащих аминокислот, дикарбоновых кислот и их амидов;
2) молекулярная масса, определяемая по скорости седиментации молекул белка при ультрацентрифугировании или методом светорассеяния. Как и для всякого высокополимерного вещества, молекулярная масса белков фактически представляет собой среднюю статистическую величину из молекулярных весов многочисленных макромолекул различной степени полимеризации. Расчет его производится с учетом констант седиментации S и коэффициента диффузии раствора белка D;
3) характеристическую вязкость;
4) удельный гидродинамический объем растворенных частиц белка;
5) осевое соотношение растворенных частиц f/fo, характеризующее степень ассиметричности молекул.
При этом, однако, имеет большое значение растворитель, которым обрабатывалась клейковина или выделенные из нее глиадин и глютенин. Так, например, для глиадина, растворенного и 0,01 M HCl, молекулярная масса была определена в 30,000, тогда как тот же препарат при растворении в 4M гуанидинхлориде дал величину молекулярной массы 26000; в последнем случае, очевидно, наблюдалась большая дезагрегация макромолекулы.
Все приводимые ниже данные были получены при растворении глиадина, глютенина или свежеотмытой сырой клейковины в 0,06 н. — 0,01 и. уксусной кислоте или в алюминиево-лактатном буфере при pH 3,1, иначе говоря, в условиях, исключающих денатурацию белков. В отдельных случаях в кислый растворитель прибавляли мочевину в концентрации 3 М, разрыв водородных связей, происходящий при этом, значительно облегчает растворение белковых веществ.
Изучение растворов клейковины методом свободного электрофореза ее растворов или электрофореза на крахмальном геле показало возможность выделения по крайней мере девяти компонентов, один из которых имел очень большой молекулярный вес и не диффундировал в гель (рис. 6); эта фракция была идентифицирована как глютеиин, остальные восемь — как глиадин. Аналогичные фракции были получены разделением раствора клейковины на колонке Сефадекс-100, Сефадекс-75 и на поликриламидном геле. Методом ультрацентрифугирования было установлено, что фракции глиадина, разделенные электрофорезом, имеют приблизительно одинаковую молекулярную массу, в среднем около 40 000. Дальнейшие исследования показали, что эти данные относятся к агрегированным молекулам белка; если же исключить эффект агрегации и очистить препарат от примесей других белков, то молекулярная масса глиадина будет соответствовать 25 000—27 000. Такие же величины были получены расчетным путем по данным аминокислотного состава.
Белковые вещества клейковины

В отличие от глиадина глютенин представляется гетерогенным и имеет широкий спектр молекулярной массы — от 500 000 до нескольких миллионов, в среднем 1,5—2,0 млн.; именно вследствие своей высокой молекулярной массы он не мигрирует в крахмальный гель. Дальнейшие исследования показали, что препараты классического глиадина, выделенного по Осборну, содержат примесь белка, имеющего молекулярную массу около 100 000. По аминокислотному составу, растворимости, вязкости растворов, константам седиментации и диффузии эта фракция соответствовала низкомолекулярным фракциям глютенина. Путем хроматографии на колонке Сефадекс Г-100 ее можно удалить и получить чистый глиадин молекулярной массы около 26 000.
Теоретический и практический интерес имеет выяснение роли сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в определении реологических свойств клейковины, ее компонентов и пшеничного теста в целом. Несмотря на то что этот вопрос привлекает очень большое внимание и количество опубликованных в этом направлении исследований необычайно велико, в настоящее время делать окончательные выводы не представляется возможным.
На первом этапе изучения взаимосвязи между свободными сульфгидрильными группами, дисульфидными мостиками и реологическими свойствами теста вопрос решали в упрощенной форме, которая, однако, не выдержала ни теоретической, ни экспериментальной проверки. Именно исходя из того, что при образовании макромолекулы белка существенное значение имеет полимеризация за счет образования межмолекулярных дисульфидных связей, предположено было, что при окислении теста и клейковины происходит окисление свободных тиоловых групп и соответственно образование новых дисульфидных мостиков.
С этой позиции изменения свойств клейковины в сторону ее укрепления рассматривали как следствие окисления сульфгидрильных соединений и прироста дисульфидных связей. Дальнейшие исследования, однако, внесли существенную поправку в изучаемый вопрос. Было установлено, что количество свободных SH-групп в пшеничном тесте настолько незначительно по сравнению с имеющимися дисульфидными связями, что даже полное их окисление не может вызвать заметного изменения реологических свойств системы. Была высказана гипотеза, что реологические свойства клейковины и теста определяются расщеплением и преобразованием поперечных связей между полипептидными цепями по следующему уравнению:
R1SSR2 + XSH → R1SSX + R2SH;
R1SSX + R3SH → R1SSR3 + XSH,

где R1, R2, R3 - представляют собой пептидные цепи, a SH-тиоловое соединение, например цистеин или глютатион, или пептидная цепь, содержащая цистеин.
Этой реакцией можно объяснить релаксацию напряжения (рис. 7). Окисление или блокировка тиоловых групп приводит в результате к подавлению обменной реакции и в связи с этим к увеличению вязкости или времени релаксации.
Белковые вещества клейковины

Таким образом, окисление белковых веществ муки влияет на свойства теста не увеличением числа дисульфидных групп, а снижением содержания тиоловых групп. Проведенные в дальнейшем исследования процесса окисления тиоловых соединений пшеничного теста и клейковины внесли еще ряд поправок. Было установлено, что при окислении цистеина образуется не только цистин, но и другие продукты, в частности цисте-инсульфиновая и цистеин-сульфоновая кислоты. Прямые опыты восстановления клейковины и последующего ее окисления йодатом калия, броматом калия и персульфатом показали очень большой дисбаланс между суммой сульфгидрильных и дисульфидных групп в ней после окисления. Ниже приводится содержание сульфгидрильных и дисульфидных групп в клейковине до и после окисления.
Белковые вещества клейковины

Окисление тиоловых групп йодатом калия протекает очень быстро, уже через 30 мин воздействия последние практически исчезают, однако баланса между количеством сульфгидрильных групп и образовавшимися дисульфидными группами нет. Следовательно, значительная часть тиоловых соединений превратилась в какие-то другие вещества, но не цистин, как это предполагалось по изложенной выше гипотезе. Окисление SH броматом калия протекает очень медленно, требуется не менее 24 ч, для того чтобы можно было бы обнаружить снижение их количества, в этом случае также отсутствует баланс между исчезнувшими SH и образовавшимися S—S-группами. Эти данные показывают, что процессы окисления и восстановления SH- и S—S-групп в тесте протекают значительно сложнее, чем предполагалось ранee. Отсутствие пропорциональности между количеством окисленных сульфгидрильных групп и снижением количества йодноватокислого калия при воздействии его на бездрожжевое тесто было отмечено также и другими авторами; по-видимому, при этом йодат расходовался на окислении еще каких-то других соединений. При этом следует учесть и высокую реактивоспособность, но крайней мере, части SH-групп, которые легко могут подвергаться окислению в процессе растворения и получения препаратов белка или клейковины. По существу, эти данные ставят под сомнение все многочисленные попытки установить какую-либо закономерную взаимосвязь между окислением сульфгидрильных групп и изменением реологических свойств клейковины и теста. В последнее время изучалась возможность взаимообмена белковых веществ клейковины с тиоловыми соединениями. В ряде работ было изучено взаимодействие меченого по 35 S цистеина с белковыми веществами клейковины и установлено, что около 24—38% добавленного в тесто при замесе вещества обнаруживается в клейковинной фракции при замесе теста в течение от 3 мин до 1 ч, Аналогичные данные были получены в отношении меченого по 35 S глютатиона; в этом случае в клейковинной фракции было обнаружено от 29 до 38% меченого глютатиона, причем для его включения потребовался также довольно длительный замес.
На основании выше приведенных данных, можно сделать вывод, что реакция взаимодействия белков клейковины с добавляемыми извне тиоловыми соединениями низкой молекулярной массы протекает довольно медленно. По-видимому, аналогичная реакция с эндогенными белковыми тиоловыми соединениями теста, содержание которых чрезвычайно мало, будет протекать еще более медленно; но это противоречит тому фактору, что при воздействии окислителей или восстановителей очень быстро изменяются реологические свойства теста. Необходимо получить еще много экспериментальных данных, для того чтобы вопрос изменения реологических свойств теста под влиянием окислителей и восстановителей был полностью разрешен.
Белковые вещества клейковины

Значительный интерес представляют исследования ряда ученых, которые установили, что обработка глютенина различными восстановителями — сульфитом натрия, этилмеркаптаном — сильно снижает молекулярную массу белка; он расщепляется на гомогенные частицы с молекулярной массой в 20 000, диффундирующие в крахмальный гель в отличие от исходного глютенина. Полученные продукты восстановления по сравнению с нативным белком неэластичны. Можно предположить, следовательно, что дисульфидные связи глютенина являются межмолекулярными и соединяют пептидные цепи молекулярной массы 20 000 в молекулы белка молекулярной массы 1,5-2,0 млн. Восстановление очищенного глиадина не оказывает значительного влияния на его молекулярный вес и вязкость растворов (рис. 8), некоторое снижение вязкости неочищенного глиадина после восстановления объясняется присутствием в нем фракции низкомолекулярного глютенина. При разрыве дисульфидных связей глиадина, однако, отмечается изменение формы его молекулы, она становится более асимметричной, как это показывает осевое соотношение (табл. 15). Эти данные подтверждают предположение о том, что в глиадине дисульфидные связи являются в основном внутримолекулярными. Результат воздействия на клейковинные белки восстановителей схематически изображен на рис. 4. Таким образом, изменение реологических свойств всего комплекса клейковины под действием восстановителен обусловлено изменением в первую очередь глютенина. Существенный интерес представляют данные о воздействии на белковые вещества клейковины альдегидов и диальдегидного крахмала. При взаимодействии диальдегидного крахмала с растворенной клейковиной происходит образование нерастворимого продукта высокой эластичности.
Белковые вещества клейковины

При этом происходит, по-видимому, образование поперечных связей между альдегидными группами диальдегидного крахмала и белковыми веществами клейковины следующим образом:
Белковые вещества клейковины

Исследование взаимодействия глиадина с глютаровым альдегидом подтвердило, что при этом происходит, образование поперечных связей между молекулами глиадина через посредство альдегида; последний вступает в реакцию с лизином и тирозином, содержание которых в гидролизате белка сильно снижается. Результатом полимеризации глиадина является изменение его молекулярной массы, что очень ясно проявляется при электрофорезе на крахмальном геле; электрофоретические диаграммы глиадина, обработанного глютаровым альдегидом, становятся похожими на аналогичные диаграммы глютенина. Эти данные в некоторой степени подтверждают предположение о том, что глиадин отличается от глютенина только степенью полимеризации.
Вышеприведенные экспериментальные данные, показавшие существенные различия в структуре глиадина и глютенина, и в частности в характере дисульфидных связей, не подтверждают эту гипотезу. He подтверждается она также данными, полученными применением иммуннохимических методов исследования белков. Глиадин, так же как и глютенин, обладает способностью образовывать нерастворимый комплекс (преципитат) с соответствующим антителом.
Восстановление глиадина, сопровождающееся нарушением дисульфидных связей, нарушает его антигенные свойства полностью; восстановление же глютенина также нарушает его первоначальную антигенную структуру, но при этом образуется новая структура антигена, локализованная, как это показало фракционирование на Сефадекс Г-100, в субфракции белка, имеющей молекулярную массу около 60 000. Следовательно, компоненты обоих белков, обладающие антигенными свойствами, имеют близкую, но не тождественную структуру.
Имеющиеся в литературе данные о строении полипептидных цепей глиадина и глютенина совершенно недостаточны и очень противоречивы. В частности, нет ясности в отношении количества N- и С-концевых остатков этих белков в аминокислотах, занимающих концевое положение. В отношении глиадина имеются указания о наличии в нем 4С-концевых остатков, по-видимому, глютамина, а также 4N-концевых остатков с различными аминокислотами (фенилаланин, треонин, глютаминовая кислота и лейцин). Следовательно, молекулу глиадина молекулярной массы 26 000—27 000 можно представить как состоящую из четырех полипептидных цепочек. Глютенин пшеницы исследован в этом отношении еще меньше, и имеющиеся данные также довольно противоречивы.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: