Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

24.10.2014

Определение активности амилолитических ферментов имеет большое практическое значение для регулирования качества муки. За последние годы было проведено большое количество экспериментов по отбору методов, которые позволили бы наиболее точно характеризовать муку (или зерно) по наличию в ней примеси проросшего зерна и по степени дефектности ее. Из основных функций амилаз (разжижение вязких растворов крахмала, декстринизация последнего и осахаривание) только разжижение зависит исключительно от α-амилазы. Процесс декстринизация осуществляется при участии обоих ферментов, а осахаривание в основном зависит от активности β-амилазы, хотя определенную роль в этом процессе играет и α-амилаза. Таким образом, для оценки технологических свойств муки из проросшего зерна вряд ли целесообразно и практически возможно определять активность только одного из двух ферментов амилазного комплекса; определяют активность обоих ферментов.
Активность любого фермента определяется степенью его воздействия на специфический субстрат за единицу времени и при стандартизированных условиях среды, в которой осуществляется ферментная реакция. Следовательно, активность α- и β-амилазы муки или размолотого зерна можно характеризовать изменением вязкости крахмального клейстера по накоплению декстринов или же по образованию мальтозы. На этих ферментных реакциях основаны многочисленные методы определения активности амилолитических ферментов, принятые в настоящее время в практике оценки качества зерна и муки. Этих методов He менее 20 (основных). Все они разделены на две группы. На рис. 109 представлены эти методы с краткой их характеристикой. К первой группе относятся методы, основанные на определении относительной активности фермента в испытуемом образце. Вторая группа включает методы, основанные на определении активности α-амилазы (преимущественно) в естественных условиях, т. е. при автолизе зернового шрота или муки.
За последние годы во многих странах Западной Европы и США проводились исследования методов определения активности α-амилазы и степени дефектности, муки из проросшего зерна. Эта работа была организована Международным обществом по химии зерна (МОХЗ), одной из задач которого является разработка международных стандартов на методы определения качества зерна, муки и хлеба. Этими же вопросами занималась и Американская ассоциация зерновых химиков.
В соответствии с принятыми МОХЗ положениями, исследования проводились во многих странах по общему плану и на одних и тех же образцах зерна и муки.
При изучении каждого метода определяли его воспроизводимость при работе в различных лабораториях и на разных экземплярах приборов, а также и в одной и той же лаборатории на одном и том же приборе. Наряду с этим устанавливали влияние различных факторов на результаты анализов, а также взаимосвязь показателей, характеризующих активность α-амилазы проросшего зерна различными методами.
Для обработки результатов опытов применяли методы вариационной статистики, причем рассчитывали следующие величины: среднюю арифметическую — х и ее ошибку Sx; среднее стандартное отклонение, рассчитанное по формуле

Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

где X — значение отдельных вариантов;
n — число вариантов;
n—1 — число степеней свободы.
Коэффициент вариации V, рассчитанный по формуле
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

характеризует воспроизводимость метода. Взаимосвязь между показателями, полученными различными методами, выражалась величиной коэффициентов корреляции, определяемых по формуле
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

Наиболее обстоятельно были изучены три метода:
1) колориметрический метод, основанный на определении цвета продуктов распада крахмала с раствором йода;
2) метод Риттера, основанный на том же принципе;
3) метод определения «числа падения» (метод Хагберга). Кроме того, был изучен метод Леммерцаля (декстриновый метод) в сопоставлении с методом числа падения и некоторыми другими.
Колориметрический метод
Метод основан на определении относительной активности фермента по воздействию вытяжки из испытуемого образца на крахмальный субстрат. Известно, что в некоторых границах концентраций фермента в реагирующей среде наблюдается обратная зависимость между временем, необходимым для достижения определенной степени гидролиза субстрата, и активностью «фермента. В применении к амилазам этот принцип был разработан Вольгемутом и в настоящее время положен в основу многочисленных модификаций способов характеристики муки с примесью проросшего зерна.
Сущность способа Вольгемута заключается в добавлении различных количеств вытяжки, содержащей фермент, к стандартному крахмальному субстрату и определении окраски последнего с йодом через определенный промежуток времени и при определенных условиях реакции.
Для оценки активности α-амилазы муки и ферментных препаратов наиболее широко применяются методы Сандстедта, Книн и Блиша, принятые как стандартные Американской ассоциацией зерновых химиков.
В его основу положен способ Вольгемута, но с существенными поправками. По стандартизованной методике анализа из испытуемого образца получают 5%-ную вытяжку, которой воздействуют на раствор α-амилодекстрина (первичный продукт распада крахмала, дающий с йодом синее окрашивание). Через 5—10 мин от ферментируемой смеси отбирают пробы, приливают к ним раствор йода и в компараторе сравнивают полученную окраску с окраской стандартного раствора декстрина. Возможное влияние β-амилазы исключается добавлением избытка препарата этого фермента. Активность α-амилазы испытуемого образца выражают в единицах СКВ (Сандстедт, К.нин, Блиш), рассчитывая их по формуле
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

Этот метод в США применяют для определения активности α-амилазы солода, препаратов плесневых грибов и бактерий, а также муки из проросшего зерна. Недостатками его являются длительность анализа, если испытуемый образец имеет низкую активность фермента, и визуальная оценка цвета реакции с йодом. Поэтому Ионг модифицировал метод СКВ, заменив визуальное определение цвета фотоэлектроколориметрическим. По мере деградации крахмала под воздействием α-амилазы интенсивность цветной реакции с йодом ослабевает, и соответственно снижается экстинкция раствора, определяемая в колориметре.
Активность фермента (А) выражается как функция концентрации α-амилазы и константы скорости гидролитической деградации декстрина.
Этот принцип был использован Комитетом Международного общества по химии зерна для разработки новой модификации способа определения активности α-амилазы в зерне, муке и препаратах грибных и бактериальных амилаз, которая и была испытана в широком масштабе.
При математической обработке результатов опытов, проведенных в 18 лабораториях в 12 различных странах, была получена хорошая воспроизводимость колориметрического метода, если применялись идентичные препараты растворимого крахмала (амилодекстрина) и препараты β-амилазы (табл. 164). Это относится как к пшеничной и ржаной муке, так и к измельченному зерну этих культур.
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

Если же при исследовании одного и того же образца использовали различные препараты субстрата и β-амилазы, то воспроизводимость метода значительно ухудшалась, вариационный коэффициент достигал 50%. При проведении анализа в одной и той же лаборатории воспроизводимость значительно улучшалась, коэффициент вариации понижался до 5,6%. Тип фотоэлектроколориметра, применяемого для определения интенсивности окрашивания раствора с йодом, не имеет большого значения, но повышение температуры испытуемого раствора до 30° С значительно ухудшает воспроизводимость метода.
Ra основании полученных данных Международное общество по химии зерна в 1967 г. утвердило колориметрический метод определения активности α-амилазы как стандартный для применения в странах, входящих в это общество.
Между единицами активности α-амилазы, определяемой этим методом и методом Американской ассоциации зерновых химиков, существует определенная зависимость:
Ед. СКБ = А * 0,11.

Величина активности α-амилазы, определяемой стандартным методом МОХЗ, колеблется в широких пределах в зависимости от наличия проросшего зерна — от 0,10 до 50—60 ед.
Метод Американской ассоциации зерновых химиков (СКВ) и метод Международного общества по химии зерна могут применяться только в хорошо оснащенных лабораториях и требуют для проведения стандартизованные препараты субстрата и β-амилазы.
Метод Риттера
Этот метод также основан на принципе Вольгемута и учитывает скорость гидролиза растворимого крахмала под влиянием ферментов вытяжки из испытуемой муки или шрота. Опыт проводится при оптимальной для действия α-амилазы температуре, т. е. при 60° С; пробы отбирают каждые пять минут и в них определяют цвет после прибавления раствора йода концентрации н/800. Стандартом служит 0,02%-ный раствор бихромата калия, окраска которого соответствует окраске йодного раствора.
Конец реакции характеризуется полным исчезновением красноватой окраски декстринов; время наступления этого момента, выраженное в минутах, и является «временем наступления желтой окраски». На основании многочисленных данных, полученных в производственных лабораториях в ФРГ, установлены следующие ориентировочные для пшеницы и ржи показатели (табл. 165). Метод Риттера изучался в 12 лабораториях 10 стран Европы. Полученные данные показали, что значительная часть исследуемых образцов не укладывается в пределы показателей времени наступления желтой окраски, установленные автором метода.
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

Активность α-амилазы в условиях проведения опыта была настолько низка, что желтого окрашивания раствора с йодом нельзя было обнаружить даже после 120 мин автолиза проб при 60° С. Этот метод применим только для зерна с примесью большого количества проросшего. Воспроизводимость этого метода-для образцов с более высокой активностью амилазы была значительно хуже, чем воспроизводимость колориметрического метода Международного общества по химии зерна. На этом основании метод Риттера не был рекомендован к широкому использованию.
Следует отметить, что недавно проведенные во ВЗИППе исследования также подтвердили малую чувствительность метода Риттера по сравнению с другими методами определения активности α-амилазы.
Метод числа падения (метод Хагберга)
В отличие от первых двух рассмотренных методов, данный метод основан на принципе определения активности α-амилазы в естественной среде, — в мучной болтушке, прогреваемой в кипящей воде, т. е. в условиях, близких к выпечке хлеба.
В зависимости от активности фермента и свойств крахмала при этом происходит разжижение крахмала в большей или меньшей степени. Вязкость полученного клейстера измеряется по скорости погружения плунжера вискозиметра в болтушке.
Показателем служит продолжительность погружения в секундах, обозначаемая как число падения (ЧП).
Прибор Хагберга состоит из водяной бани, вискозиметрических трубок и плунжера (рис. 110) строго стандартизованных размеров.
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

Скорость прогрева мучной болтушки при погружении в кипящую баню для ее клейстеризации довольно близка к скорости прогрева мякиша хлеба из навески теста в 70 г при обычной температуре пекарной камеры (около 250°).
При нагреве водно-мучной болтушки точка термической инактивации α-амилазы достигается за 30 сек, а при выпечке теста за 40 сек.
В исследованиях этого метода приняло участие 15 стран и несколько десятков лабораторий. Кроме того, ряд работ был проведен (вне рамок Международного общества но химии зерна) в некоторых институтах Европы; Американская ассоциация зерновых химиков организовала специальную группу для изучения методики проведения анализа зерна и муки по данному методу.
При точном проведении анализа и применении стандартной аппаратуры этот метод дает хорошую воспроизводимость.
Опыты показали, что большое влияние на величину ЧП оказывает степень измельчения образца зерна (или муки). При наличии в нем большого количества крупных частиц (сход с сита с отверстиями диаметром 0,5 мм) за непродолжительное время прогрева суспензии крахмал не успевает клейстеризоваться; вязкость, а следовательно, и число падения получаются пониженными. При очень сильном измельчении образца мучная суспензия имеет более высокое ЧП, чем суспензия того же образца, но менее измельченного.
Этот вопрос изучался в 23 лабораториях США. Было установлено, что для получения устойчивых и сравнимых результатов необходимо, чтобы испытуемый образец имел следующее процентное содержание частиц по крупности:
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

Ошибки при анализе могут быть вызваны отклонением температуры кипящей водяной бани в лабораториях, расположенных в зонах с различным атмосферным давлением (т. е. находящихся на разной высоте над уровнем моря), расхождения в температуре кипения бани достигают 2—3°С; повышение же температуры кипения от 98 до 101°C приводит к понижению ЧП на 25—20 ед. Поэтому Американская ассоциация зерновых химиков рекомендует добавлять в воду глицерин, этиленгликоль и изопропиловый спирт для получения смеси с постоянной точкой кипения 100°C.
Имеет значение также ритм перемешивания мучной болтушки в момент ее клейстеризации; если погружение и подъем плунжера производить быстрее, чем это предусмотрено методикой, то ЧП получается более низкое.
Установлено также, что повышение активной кислотности муки (т. е. понижение величины pH) увеличивает число падения. Это наблюдается, например, при обработке муки хлором в целях улучшения ее свойств (табл. 166).
Амилолитические ферменты муки из проросшего зерна и методы определения их активности

При определении числа падения, следовательно, необходимо учитывать и активную кислотность муки.
Как и при колориметрическом методе определения α-амилазы, проведение опытов в одной и той же лаборатории повышает его воспроизводимость, вариационный коэффициент понижается до 4,9%. При этом следует отметить, что величина стандартного отклонения (S), от которой зависит вариационный коэффициент, повышается с возрастанием абсолютного значения ЧП.
Проведенные исследования позволили Международному обществу по химии зерна утвердить метод ЧП как стандартный для стран-членов этого общества. Метод ЧП применим как для пшеницы, так и для ржи.
В настоящее время метод ЧП принят Американской ассоциацией зерновых химиков и включен в книгу «Методы исследования зерна, муки и хлеба», изданную в 1967 г.
В ГДР этот метод принят как ведомственный стандарт для предприятий, перерабатывающих зерно и муку.
В Швеции метод ЧП принят как официальный для определения проросшего зерна в партиях пшеницы и ржи. Исследования, проведенные в ПНР, позволили рекомендовать его как обязательный для применения в промышленности, перерабатывающей зерно в муку.
Метод Леммерцаля
В ФРГ с 1955 г. широко применяется для обнаружения проросшего зерна декстриновый метод, по которому активность α-амилазы определяется также колориметрически по реакции с йодом. Ho процесс гидролиза проводится не в вытяжке испытуемой муки, а непосредственно в мучной болтушке, в которую добавляется искусственный субстрат — декстрин, обладающий еще высокой молекулярной массой и дающий с йодом синюю окраску. Через определенное время (обычно через 18—20 ч автолиза при комнатной температуре) отбирают пробу ферментируемой смеси и добавляют раствор йода. Полученную окраску сравнивают с цветной шкалой, характеризующей реакцию различных продуктов гидролиза крахмала с йодом. Эта шкала имеет 30 оттенков цвета, и декстриновые числа выражаются величинами от 1 до 30, причем максимальной величине соответствует и наибольшая активность α-амилазы.
По данным Леммерцаля и других авторов, нормальная ржаная мука имеет декстриновое число в пределах 12—14 ед., слабодефектная мука — 15—19 ед., 20—24 ед. характеризуют муку средней степени дефектности и 25—30 — сильно дефектную. Пшеничная мука нормального качества имеет декстриновое число 12—13 ед.
Воспроизводимость метода Леммерцаля не изучалась, но, по-видимому, при точном соблюдении методики анализа и наличии стандартного субстрата и цветной шкалы, она вполне удовлетворительна.
Метод Бенделоу
В отличие от описанных выше методов, основанных на измерении цветной реакции продуктов гидролиза крахмала йодом, по методу, предложенному Бенделоу, определяется количество мальтозы, образовавшейся в результате воздействия вытяжки из зерна или муки на клейстеризованный крахмал. При этом определяется как суммарное количество мальтозы, обусловленное гидролизом крахмала α- и β-амилазой, так и количество мальтозы, образовавшейся в результате воздействия одной только α-амилазы. В последнем случае β-амилаза предварительно инактивируется добавлением фенилмеркурохлорида. Количество мальтозы, образовавшейся при кратковременном воздействии вытяжки из муки, определяют при помощи цветной реакции с динитросалициловой кислотой. Институт по изучению пшеницы в г. Кинсли (Ирландия) разработал подробную методику проведения анализа этим методом. Ферментную активность выражают в мг мальтозы, образованной 1 г пшеницы.
Этот метод широко применяется в Ирландии для определения примеси проросшего зерна в пшенице, он обладает хорошей воспроизводимостью.
Метод определения диастатической активности
Этот метод, предложенный Рамзей в 1922 г., в настоящее время стандартизован Американской ассоциацией зерновых химиков. Суммарное количество образовавшихся при автолизе муки восстанавливающих сахаров определяется по феррицианидному методу, позволяющему одновременно производить большое количество анализов. Активность амилазного комплекса выражается в мг мальтозы, образовавшейся за 1 ч автолиза 1 г муки при 30° С. Хорошая воспроизводимость метода установлена многочисленными исследованиями, проведенными Американской ассоциацией зерновых химиков.
Величина мальтозного числа пшеничной муки колеблется от 150 до 400 мг мальтозы, причем последняя величина соответствует наличию проросшего зерна.
Амилографический метод
Максимальная высота кривой, получаемая при измерении вязкости клейстеризуемой болтушки муки в амилографе Брабендера, является показателем амилазной активности пшеничной и ржаной муки (амилографическое исследование широко применяется во всех странах Европы и стандартизовано Американской ассоциацией зерновых химиков, 1962).
Кроме описанных выше методов, в России для оценки качества муки из проросшего зерна используется еще несколько методов, относящихся ко второй группе, т. е. определяющих активность амилазы в естественной среде.
Определение автолитической активности муки
По этому методу, предложенному Т. И. Шкваркиной, К. Н. Чижовой и др., определяют суммарное количество растворимых веществ, образовавшихся в процессе клейстеризации мучной болтушки. Метод включен в ГОСТ 9404—60 на методы определения качества муки и широко применяется в хлебопекарной промышленности.
Метод колобковой выпечки (экспресс-выпечка)
Метод заключается в выпечке бездрожжевого теста и в определении суммы растворимых веществ мякиша хлеба. Предложенный Н. П. Козьминой для распознавания примеси проросшего зерна к пшеничной муке, в настоящее время применяется и для анализа ржаной муки.
Колориметрический метод ВНИИХПа
Метод основан на изменении окраски мучной вытяжки с добавлением крахмального (картофельного) клейстера. Йодокрахмальная реакция, дающая в ряде пробирок окраску синюю, фиолетовую темно- и буро-красную, свидетельствует о нормальном качестве зерна. Появление бледно-розовой окраски указывает на слабую степень прорастания зерна. Обесцвечиваете одной из пробирок свидетельствует о наличии сильно проросшего зерна.
Метод Института биохимии Академии наук России
Метод основан на йодокрахмальной реакции. Ряд пробирок заполняется разным количеством мучной вытяжки (от 0,1 мл до 1 мл): с 1%-ным раствором растворимого крахмала и выдерживается 30 мин при 40° С. Нормальная мука дает при этом типичное синее окрашивание.
При наличии в муке α-амилазы появляется фиолетовая окраска. Чем активнее α-амилаза взятой муки, тем меньшее количество вытяжки вызывает фиолетовое и даже красно-фиолетовое окрашивание.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: